Quels sont les types de colorants fluorescents de fluo ?

Pour le développement de la cyclométrie de flux, la force d'impulsion est la plus importante sur les anticuerpos, suivis des colorants fluorescents qui coïncident avec les capacités de détection de l'instrument. Les teintes fluorescentes ne suivent pas le rythme de la quantité de canaux de détection des instruments.

Les teintes fluorescentes de flux continues existantes peuvent être divisées en 11 catégories :

1. Moléculas organiques petites

Lorsqu'il s'agit de molécules biologiques petites, la majorité des femmes doivent être confuses, mais si certains exemples me sont définitivement donnés.

FITC (389 Da), Alexa Fluor 488 (FITC analogique, 643 Da), Texas Red (TxRed, 625 Da), Alexa Fluor 647 (1155 Da), Pacific Blue (242 Da) et Cy5 (242 Da) 762 Da). Est-ce que c'est fondamentalement utilisé ?

Ces petites molécules organiques ont un spectre d'émission constant et un petit spectre d'émission de Stokes (différence entre les longitudes de l'onde d'excitation et d'émission, environ 50-100 nm), sont photoestables et se conjuguent facilement avec des anticuerpos, car elles sont utilisées largement.

Il est important de mentionner que les teintes Alexa Fluor sont plus photocompatibles avec FITC, car si vous souhaitez obtenir une image, c'est votre option.

2. Ficobiliprotéine

Les ficobiliprotéines sont des molécules de protéines de grande taille extraites d'algues comme les cianobactéries et les dinoflagelados, par exemple, la ficoérythrine (PE) a un poids moléculaire de 240 000 Da. Ces protéines ont de grandes concentrations de Stokes (75-200 nm) et des spectres d'émission stables. Étant donné que les ficobiliprotéines sont grandes, il y a normalement une proportion de protéines en fluorocromo de 1:1 pendant la conjugaison, ce qui les rend utiles pour la cytométrie de flux quantitative.

Cependant, les ficobiliprotéines sont sensibles à la photo, car il n'est pas recommandé d'exposer de manière prolongée ou répétée les sources de lumière d'excitation.

Dans la famille des ficobiliprotéines, outre la ficoérythrine (PE), il existe l'aloficocianine (APC) et la protéine de clorofila Momordica (PerCP).

3. Points cuánticos

Les points cuánticos (Qdots) sont des nanocristaux semi-conducteurs avec des spectres d'émission de fluorescence qui sont directement liés à la taille des nanocristaux. S'excitant mieux avec la lumière ultraviolette ou violette, mais aussi s'excitant facilement avec d'autres lasers en petites cantidades, car lorsque vous utilisez Qdots dans des expériences multiparamétriques, cette petite excitation d'autres longitudes de l'onde des lasers complique la compensation de fluorescence.

Ainsi, même si les teintes de points cuánticos ont un haut brillant, ces réactifs se remplacent principalement par des teintes poliméricos en esquemas multiparamétricos en raison de la difficulté de ces problèmes de compensation et de la difficulté d'unir Qdots à anticuerpos.

4. Teintes de polymères

Les teintes macromoléculaires (polymères) consistent en des chaînes de polymères qui détectent des signaux de lumière et peuvent « sintoniser » l'absorption et l'émission de longitudes d'une onde de lumière spécifique, selon la longueur de la chaîne de polymères et les sous-unités moléculaires qui sont unies. Ces teintes sont très stables et ont des efficacités cuánticas similaires aux ficobiliprotéines avec une photoestabilidad très améliorée.

Dado que les colorants poliméricos peuvent être fabriqués pour absorber seules les longitudes de l'onde de lumière spécifique, afin d'éviter le problème de l'excitation de Qdots avec les longitudes de l'onde croisée.

Les représentants typiques des teintes poliméricos sont le violet brillant (BV), l'ultraviolet brillant (BUV) et l'azul brillant (BB).

5. Teintes en tandem

Les teintes en tandem associent des fibres chimiques (PE, APC, PerCP) ou des teintes macromoléculaires (BV421, BUV395) avec des teintes organiques fluorescentes de petites molécules (Cy3, Cy5, Cy7) et utilisent le transfert d'énergie de fluorescence (FRET) pour former un laser seul. Plus de longitudes de l'onde de la lumière émise est excitée.

Par exemple, l'excitation maximale de Texas Red est de 589 nm, tandis que l'émission de PE est de 585 nm, car lorsque l'on associe PE à Texas Red, la lumière d'émission de PE excite Texas Red à travers le FRET, ce qui fait que PE-TxRed est disponible à 488 nm. ou une excitation laser de 532 nm.

La même méthode peut également être utilisée pour protéger les poliméricos avec des teintes de petites molécules organiques.

Les teintes en même temps sont très brillantes et ont de grandes valeurs de destruction de Stokes (150-300 nm), qui sont utiles pour détecter les antigènes de basse densité. Cependant, les colorants en même temps sont moins stables que les fluorochromes donateurs et l'efficacité du transfert d'énergie varie d'un lot à l'autre, ce qui complique la compensation.

6. Iones de métaux pesados

Les ions métalliques pesados ​​ne sont pas strictement fluorescents, mais nous les mentionnons également ici.

Les anticuerpos utilisés dans la cytométrie de masse ne sont pas conjugués avec la fluorescéine, mais ils sont conjugués avec des ions métalliques pesados ​​d'un seul isotope dans la série des lantánidos. Il y a actuellement 35 isotopes de lantánidos disponibles commercialement pour la conjugaison des anticuerpos. Ces sondes ne sont pas fluorescentes et seules sont adaptées à la citométrie de masse.

7. Protéine fluorescente

Les protéines fluorescentes sont utilisées avec la fréquence comme systèmes informateurs pour l'expression génétique. La protéine verte fluorescente (GFP) d'Aequorea victoria est la plus utilisée. C’est cela qui dérive du CFP et du YFP.

La protéine fluorescente rouge (DsRed) est dérivée de l'anémone de la mer du grand Discosoma, et la prochaine génération de protéines fluorescentes monomères (mCherry, mBanana) est dérivée de DsRed et a des spectres d'émission et d'excitation plus étendus.

Avec la maturité de la technologie de clonage de gènes, il existe des centres de protéines fluorescentes, des spectres d'excitation et d'émission de l'ultraviolet jusqu'à l'infrarouge proche.

8. Teintes d'acide nucléique

Les teintes d'acide nucléique se trouvent dans l'ADN, l'ARN ou les ambos. Vous pouvez utiliser la quantification de l'ADN pour l'analyse du cycle cellulaire (p. ej., PI, 7-AAD, DyeCycle Violet, DAPI), la classification des chromosomes (p. ej., Hoescht 33342, Chromomycin A3), la classification des cellules mères au milieu de l'analyse de la population latérale (p. ej., Hoescht). 33342), Live et les cellules muertas se différencient et les bactéries se classent.

Le niveau de prolifération peut déterminer la combinaison de colorants d'acide nucléique avec un autre marqueur, comme un anti-bromodesoxiuridine conjugué avec un colorant fluorescent (BrdU).

9. Teintes de prolifération cellulaire

La prolifération cellulaire est au milieu de l'incubation des cellules avec BrdU (bromodesoxiuridina), qui est incorporée à la synthèse de l'ADN cellulaire et elle est ensuite liée aux anticuerpos et aux teintes d'ADN dirigées contre BrdU. Sans embargo, cette méthode n’est pas adaptée aux studios de prolifération sur une grande place.

Le succinimidil ester de carboxyfluoresceína (CFSE) peut être utilisé pour raster plusieurs divisions de cellules en prolifération. Les variantes rouges et moradas des teintes CFSE sont également disponibles maintenant. En concentrations appropriées, ces teintes n'affectent pas la croissance ou la morphologie cellulaire, c'est pourquoi elles sont adaptées aux studios de prolifération sur une grande place.

10. Tinte de muerte celulaire

La viabilité cellulaire peut déterminer l'intermédiaire des colorants d'exclusion (par exemple, yoduro de propidio, DAPI) ou l'intermédiaire de l'union des colorants avec les fibres intracellulaires.

Les teintes d'exclusion ne peuvent pas être fijares et seules sont adaptées aux cellules qui ne sont pas infectieuses et nécessitent une analyse immédiate.

Les teintes d'amine, y compris Live/Dead (ThermoFisher), Zombie (Biolegend) ou Fixable Viablity (BD Biosciences), sont adaptées aux cellules fijadas et, par conséquent, aux cellules infectieuses, aux cellules infectées avec des antigènes intracellulaires, aux cellules fijadas avec paraformaldehído.

11. Indicateur de couleur de calcium

Les indicateurs de calories expérimentent un changement de couleur à l'unité et peuvent être utilisés pour indiquer l'activation et la signalisation cellulaire.

Le colorant le plus utilisé est celui de l'indo-1, la sonde de calcium bifásico UV. Également des sondes de calcium bleu-vert pour fluo-3.