Quais são os tipos de corantes fluorescentes de flujo?

Para o desenvolvimento da citometria do fluxo, a força impulsora mais importante são os anti-corpos, seguidos dos corantes fluorescentes que coincidem com as capacidades de detecção do instrumento. As cores fluorescentes ainda não acompanham o ritmo da quantidade de canais de detecção de instrumentos.

As cores fluorescentes de fluxo contínuas existentes podem ser divididas nas seguintes 11 categorias:

1. Moléculas orgânicas pequenas

Quando se trata de pequenas moléculas orgânicas, a maioria das pessoas deve ser confundida, mas se alguns exemplos, definitivamente me darão conta.

FITC (389 Da), Alexa Fluor 488 (análogo FITC, 643 Da), Texas Red (TxRed, 625 Da), Alexa Fluor 647 (1155 Da), Pacific Blue (242 Da) e Cy5 (242 Da) 762 Da). Você é basicamente usado?

Estas pequenas moléculas orgânicas têm um espectro de emissão constante e um pequeno deslocamento de Stokes (diferença entre as longitudes de onda de excitação e emissão, aproximadamente 50-100 nm), são fotoestáveis ​​​​e são facilmente conjugados com anti-corpos, para serem utilizados ampliamente.

Vale a pena mencionar que as cores Alexa Fluor são mais fotoestáveis ​​​​que FITC, para quem deseja obter uma imagem, sua opção.

2. Ficobiliproteína

Las ficobiliproteínas são moléculas de proteína de grande tamanho extraídas de algas como cianobactérias e dinoflagelados, por exemplo, a ficoeritrina (PE) tem um peso molecular de 240.000 Da. Estas proteínas têm grandes deslocamentos de Stokes (75-200 nm) e espectros de emissão estáveis. Devido às ficobiliproteínas serem grandes, normalmente há uma proporção de proteína com fluorocromo de 1:1 durante a conjugação, o que as torna úteis para a citometria do fluxo quantificado.

No entanto, as ficobiliproteínas são suscetíveis ao fotoblanqueamento, por isso não é recomendada a exposição prolongada ou repetida a fontes de luz de excitação.

Na família das ficobiliproteínas, além da ficoeritrina (PE), existe a aloficocianina (APC) e a proteína da clorofila Momordica (PerCP).

3. Pontos cúbicos

Os pontos cúbicos (Qdots) são nanocristais semicondutores com espectros de emissão de fluorescência que estão estreitamente relacionados com o tamanho dos nanocristais. Se excita melhor com a luz ultravioleta ou violeta, mas também se excita facilmente com outros lasers em pequenas quantidades, porque quando se usa Qdots em experimentos multiparamétricos, esta pequena excitação de outras longitudes de onda dos lasers complica a compensação de fluorescência.

Como tal, mesmo que os tons de pontos cúbicos tenham um brilho alto, esses reativos são substituídos principalmente por tons poliméricos em esquemas multiparamétricos devido à dificuldade desses problemas de compensação e à dificuldade de unir Qdots a anticuerpos.

4. Tintas de polímeros

Os tons macromoleculares (polímeros) consistem em cadeias de polímeros que reconhecem sinais de luz e podem 'sintonizar' a absorção e emissão de longitudes de onda de luz específicas, dependendo da longitude da cadeia de polímero e das subunidades moleculares que estão unidas. Esses tons são muito estáveis ​​​​e têm eficiências significativas semelhantes às ficobiliproteínas com uma estabilidade de foto muito melhorada.

Dado que os corantes poliméricos podem ser fabricados para absorver apenas as longitudes de onda de luz específicas, evita-se o problema da excitação de Qdots com longitudes de onda cruzada.

Os representantes típicos dos tons poliméricos são o violeta brilhante (BV), o ultravioleta brilhante (BUV) e o azul brilhante (BB).

5. Tintas em tandem

Los tintes em tandem acoplan quimicamente ficobiliproteínas (PE, APC, PerCP) ou matizes macromoleculares (BV421, BUV395) com tintes orgânicos fluorescentes de molécula pequena (Cy3, Cy5, Cy7) e usam a transferência de energia de fluorescência (FRET) para formar um único laser Mais longitudes de onda de luz emitida se excita.

Por exemplo, o máximo de excitação do Texas Red é de 589 nm, enquanto a emissão de PE é de 585 nm, por isso que o PE-TxRed acoplado está disponível em 488 nm. ou excitação laser de 532 nm.

O mesmo método também pode ser usado para proteção contra corpos poliméricos junto com matizes de pequenas moléculas orgânicas.

Os tons em tandem são muito brilhantes e têm grandes valores de deslocamento de Stokes (150-300 nm), que são úteis para detectar antígenos de baixa densidade. No entanto, os corantes em conjunto são menos estáveis ​​que os fluorocromos doadores e a eficiência da transferência de energia varia de um lote a outro, o que complica a compensação.

6. Íons de metais pesados

Os íons de metais pesados ​​não são estritamente fluoresceína, mas também os mencionamos aqui.

Os anti-corpos usados ​​na citometria de massa não são conjugados com fluoresceína, mas sim conjugados com íons de metais pesados ​​de um único isótopo na série dos lantánidos. Atualmente há 35 isótopos de lantânios disponíveis comercialmente para a conjugação de anticuerpos. Estas sondas não são fluorescentes e apenas são adequadas para citometria de massa.

7. Proteína fluorescente

As proteínas fluorescentes são utilizadas com frequência como sistemas informativos para a expressão genética. A mais utilizada é a proteína verde fluorescente (GFP) de Aequorea victoria. Isso é derivado de CFP e YFP.

A proteína fluorescente vermelha (DsRed) é derivada da anémona de mar do Hongo Discosoma, e a próxima geração de proteínas fluorescentes monoméricas (mCherry, mBanana) é derivada de DsRed e tem espectros de emissão e excitação mais amplos.

Com a maturidade da tecnologia de clonagem de genes, existem centenas de proteínas fluorescentes, espectros de excitação e emissão do ultravioleta até o infravermelho próximo.

8. Tons de ácido nucléico

Os tons de ácido nucleico são unen al ADN, al ARN oa ambos. Você pode usar para quantificar o ADN para a análise do ciclo celular (p. ej., PI, 7-AAD, DyeCycle Violet, DAPI), classificar cromossomos (p. ej., Hoescht 33342, Chromomicina A3), classificar células mães por meio de análise de população lateral (p. ej., Hoescht 33342), Live e las células mortas são diferenciadas e bactérias são classificadas.

O nível de proliferação pode ser determinado pela combinação de corantes de ácido nucleico com outro marcador, como um anti-bromodesoxiuridina conjugado com corante fluorescente (BrdU).

9. Tons de proliferação celular

A proliferação celular foi incubada com células com BrdU (bromodesoxiuridina), que se incorporaram à síntese de ADN celular e depois foram com anti-corpos e tons de ADN direcionados contra BrdU. No entanto, este método não é adequado para estudos de proliferação em longo prazo.

O succinimidil éster de carboxifluoresceína (CFSE) pode ser usado para rastrear múltiplas divisões de células em proliferação. As variantes roxas e moradas dos tons CFSE também estão disponíveis agora. Em concentrações apropriadas, esses tons não afetam o crescimento ou a morfologia celular, o que os torna adequados para estudos de proliferação em um largo espaço.

10. Tinta de morte celular

A viabilidade celular pode ser determinada por meio de corantes de exclusão (p. ej., iodo de propídio, DAPI) ou por meio da união de corantes com aminas intracelulares.

Os tons de exclusão não podem ser estabelecidos e apenas adequados para células que não são infecciosas e requerem uma análise imediata.

As tintas de amina, incluindo Live/Dead (ThermoFisher), Zombie (Biolegend) ou Fixable Viablity (BD Biosciences), são adequadas para células fijadas e, por isso, com células infecciosas, células teñidas com antígenos intracelulares, células fijadas com paraformaldeído.

11. Indicador corante de cálcio

Os tons indicadores de cálcio experimentam uma mudança de cor ao unir o cálcio e podem ser usados ​​para indicar a ativação e sinalização celular.

O corante mais utilizado segue após o indo-1, a sonda de cálcio bifásico UV. Também há sondas de cálcio azul-verde para fluo-3.