Cuáles son los tipos de colorantes fluorescentes de flujo?

Para el desarrollo de la citometría de flujo, la fuerza impulsora más importante son los anticuerpos, seguidos de los colorantes fluorescentes que coinciden con las capacidades de detección del instrumento. Los tintes fluorescentes aún no siguen el ritmo de la cantidad de canales de detección de instrumentos.

Los tintes fluorescentes de flujo continuo existentes se pueden dividir en las siguientes 11 categorías:

1. Moléculas orgánicas pequeñas

Cuando se trata de moléculas orgánicas pequeñas, la mayoría de la gente debe estar confundida, pero si doy algunos ejemplos, definitivamente me daré cuenta.

FITC (389 Da), Alexa Fluor 488 (análogo FITC, 643 Da), Texas Red (TxRed, 625 Da), Alexa Fluor 647 (1155 Da), Pacific Blue (242 Da) y Cy5 (242 Da) 762 Da) . ¿Es básicamente usado?

Estas pequeñas moléculas orgánicas tienen un espectro de emisión constante y un pequeño desplazamiento de Stokes (diferencia entre las longitudes de onda de excitación y emisión, aproximadamente 50-100 nm), son fotoestables y se conjugan fácilmente con anticuerpos, por lo que se utilizan ampliamente.

Vale la pena mencionar que los tintes Alexa Fluor son más fotoestables que FITC, por lo que si desea obtener una imagen, son la opción.

2. Ficobiliproteína

Las ficobiliproteínas son moléculas de proteína de gran tamaño extraídas de algas como cianobacterias y dinoflagelados, por ejemplo, la ficoeritrina (PE) tiene un peso molecular de 240.000 Da. Estas proteínas tienen grandes desplazamientos de Stokes (75-200 nm) y espectros de emisión estables. Debido a que las ficobiliproteínas son grandes, normalmente tienen una proporción de proteína a fluorocromo de 1:1 durante la conjugación, lo que las hace útiles para la citometría de flujo cuantitativa.

Sin embargo, las ficobiliproteínas son susceptibles al fotoblanqueo, por lo que no se recomienda la exposición prolongada o repetida a fuentes de luz de excitación.

En la familia de las ficobiliproteínas, además de la ficoeritrina (PE), existen la aloficocianina (APC) y la proteína de clorofila Momordica (PerCP).

3. Puntos cuánticos

Los puntos cuánticos (Qdots) son nanocristales semiconductores con espectros de emisión de fluorescencia que están estrechamente relacionados con el tamaño de los nanocristales. Se excitan mejor con la luz ultravioleta o violeta, pero también se excitan fácilmente con otros láseres en pequeñas cantidades, por lo que cuando se usan Qdots en experimentos multiparamétricos, esta pequeña excitación de otras longitudes de onda de los láseres complica la compensación de fluorescencia.

Como tal, aunque los tintes de puntos cuánticos tienen un alto brillo, estos reactivos se reemplazan principalmente por tintes poliméricos en esquemas multiparamétricos debido a la dificultad de estos problemas de compensación y la dificultad de unir Qdots a anticuerpos.

4. Tintes de polímeros

Los tintes macromoleculares (polímeros) consisten en cadenas de polímeros que recogen señales de luz y pueden "sintonizar" la absorción y emisión de longitudes de onda de luz específicas, según la longitud de la cadena de polímero y las subunidades moleculares que están unidas. Estos tintes son muy estables y tienen eficiencias cuánticas similares a las ficobiliproteínas con una fotoestabilidad muy mejorada.

Dado que los colorantes poliméricos pueden fabricarse para absorber solo longitudes de onda de luz específicas, se evita el problema de la excitación de Qdots con longitudes de onda cruzadas.

Los representantes típicos de los tintes poliméricos son el violeta brillante (BV), el ultravioleta brillante (BUV) y el azul brillante (BB).

5. Tintes en tándem

Los tintes en tándem acoplan químicamente ficobiliproteínas (PE, APC, PerCP) o tintes macromoleculares (BV421, BUV395) con tintes orgánicos fluorescentes de molécula pequeña (Cy3, Cy5, Cy7) y usan la transferencia de energía de fluorescencia (FRET) para formar un solo láser Más longitudes de onda de la luz emitida se excita.

Por ejemplo, el máximo de excitación de Texas Red es de 589 nm, mientras que la emisión de PE es de 585 nm, por lo que al acoplar PE con Texas Red, la luz de emisión de PE excita Texas Red a través de FRET, lo que hace que PE-TxRed esté disponible a 488 nm. o excitación láser de 532 nm.

El mismo método también se puede utilizar para anticuerpos poliméricos junto con tintes de moléculas pequeñas orgánicas.

Los tintes en tándem son muy brillantes y tienen grandes valores de desplazamiento de Stokes (150-300 nm), que son útiles para detectar antígenos de baja densidad. Sin embargo, los colorantes en tándem son menos estables que los fluorocromos donantes y la eficiencia de la transferencia de energía varía de un lote a otro, lo que complica la compensación.

6. Iones de metales pesados

Los iones de metales pesados no son estrictamente fluoresceína, pero también los mencionamos aquí.

Los anticuerpos utilizados en la citometría de masas no se conjugan con fluoresceína, sino que se conjugan con iones de metales pesados de un solo isótopo en la serie de los lantánidos. Actualmente hay 35 isótopos de lantánidos disponibles comercialmente para la conjugación de anticuerpos. Estas sondas no son fluorescentes y solo son adecuadas para citometría de masas.

7. Proteína fluorescente

Las proteínas fluorescentes se utilizan con frecuencia como sistemas informadores para la expresión génica. La más utilizada es la proteína verde fluorescente (GFP) de Aequorea victoria. De esto se derivan CFP y YFP.

La proteína fluorescente roja (DsRed) se deriva de la anémona de mar del hongo Discosoma, y la próxima generación de proteínas fluorescentes monoméricas (mCherry, mBanana) se derivan de DsRed y tienen espectros de emisión y excitación más amplios.

Con la madurez de la tecnología de clonación de genes, existen cientos de proteínas fluorescentes, cuyos espectros de excitación y emisión van desde el ultravioleta hasta el infrarrojo cercano.

8. Tintes de ácido nucleico

Los tintes de ácido nucleico se unen al ADN, al ARN o a ambos. Se pueden usar para cuantificar el ADN para el análisis del ciclo celular (p. ej., PI, 7-AAD, DyeCycle Violet, DAPI), clasificar cromosomas (p. ej., Hoescht 33342, Chromomycin A3), clasificar células madre mediante análisis de población lateral (p. ej., Hoescht 33342), Live y las células muertas se diferencian y las bacterias se clasifican.

El nivel de proliferación se puede determinar mediante la combinación de colorantes de ácido nucleico con otro marcador, como un anti-bromodesoxiuridina conjugado con colorante fluorescente (BrdU).

9. Tintes de proliferación celular

La proliferación celular se mide incubando las células con BrdU (bromodesoxiuridina), que se incorpora a la síntesis de ADN celular y luego se tiñe con anticuerpos y tintes de ADN dirigidos contra BrdU. Sin embargo, este método no es adecuado para estudios de proliferación a largo plazo.

El succinimidil éster de carboxifluoresceína (CFSE) se puede utilizar para rastrear múltiples divisiones de células en proliferación. Las variantes rojas y moradas de los tintes CFSE también están disponibles ahora. En concentraciones apropiadas, estos tintes no afectan el crecimiento o la morfología celular, lo que los hace adecuados para estudios de proliferación a largo plazo.

10. Tinte de muerte celular

La viabilidad celular se puede determinar mediante colorantes de exclusión (p. ej., yoduro de propidio, DAPI) o mediante la unión de colorantes a aminas intracelulares.

Los tintes de exclusión no se pueden fijar y solo son adecuados para células que no son infecciosas y requieren un análisis inmediato.

Los tintes de amina, incluidos Live/Dead (ThermoFisher), Zombie (Biolegend) o Fixable Viablity (BD Biosciences), son adecuados para células fijadas y, por lo tanto, con células infecciosas, células teñidas con antígenos intracelulares, células fijadas con paraformaldehído.

11. Colorante indicador de calcio

Los tintes indicadores de calcio experimentan un cambio de color al unirse al calcio y pueden usarse para indicar la activación y señalización celular.

El colorante más utilizado sigue siendo el indo-1, la sonda de calcio bifásico UV. También hay sondas de calcio azul-verde para fluo-3.