مقدمة عن طريقة تجربة النشاط الإنزيمي المتوقف

المبدأ:

يمكن أن يقطع α-amilasa عن طريق ربط الجلوكوز α-1.4 في سلسلة أميدون في سلسلة من دكسترينا من القشرة، وكمية صغيرة من المالتوس والجلوكوز مع خطوط طول مختلفة، بطريقة يكون رد الفعل الخاص ليمون اليود أزرقًا أسودًا. يتضاءل اللون الأزرق تدريجيًا ويتحول تدريجيًا إلى لون مارون روزيزو. ترتبط سرعة إزالة اللون بالنشاط الإنزيمي، حيث يمكن للنشاط الإنزيمي حساب وسط امتصاص المحلول بعد التفاعل في الظروف القياسية.

ردود الفعل والحلول:

حل اليود الأصلي: يذوب 22.0 جم من يود البوتاسيوم ويذوب في حوالي 300 مل من الماء، ويجمع 11.0 جم من اليودو، ويذوب مع التحريك، وينقل اللون إلى طبقة حجمية 500 مل، ويعصر بالماء ويخزن في زجاجة marrón para su uso posterior (preparado una vez al mes).

محلول اليودو المخفف: 20.0 جم من اليودورو البوتاسيوم ويذوب في 300 مل من الماء، مع إضافة 2.00 مل من محلول اليودو الأصلي بدقة، ونقل كل شيء إلى مادة مخفوقة من 500 مل، ومسحها بالماء والتخزين في زجاجة المارون الخاصة بك الاستخدام الخلفي (preparado una vez al mes).

محلول أميد قابل للذوبان 20 جم/لتر: 2.000 جم من محلول أميد قابل للذوبان (في القاعدة الثانية)، بدقة 0.001 جم، مع تعليق بالماء، ناعم جدًا في 70 مل من الماء المنعش مع التحريك واستمتع بـ 30 مل من الماء ماء متنوع مرات في وعاء راسب صغير يحتوي على الميدون، يتم تضمينه في محلول، ويسخن ويبقى لمدة دقيقتين حتى يصبح شفافًا تمامًا، في حالة تبريده بدرجة الحرارة المحيطة، وينقل إلى طبقة حجمية 100 مل ويتم تخفيفها بالماء. hasta el enrase. يجب أن يقوم هذا الحل بإعداد نفس اليوم.

سدادة الفوسفات (الرقم الهيدروجيني = 6,0): 45,23 جم من حمض الفوسفات ثنائي الصوديوم و8,07 جم من حمض الستريك، تذوب في الماء وتخفف إلى 1000 مل. بعد المزج، عيار مزود بمقياس للأس الهيدروجيني.

محلول حمض الكلورايد c(HCl)=0.1mol/L.

الأدوات والتجهيزات:

مقياس الطيف الضوئي، حوض الماء بدرجة حرارة ثابتة 50 درجة مئوية - 100 درجة مئوية، الدقة ± 0.1 درجة مئوية، أنبوب القياس: 25 مم × 200 مم، مادة حجمية، أنبوبة أوتوماتيكية، مقياس كرونوميتر.

إعداد الحل الانزيمي للتجربة:

تحضير الإنزيم السائل: يتم التحضير مباشرة بمحلول السدادة، بحيث يكون نشاط الإنزيم المخفف في نطاق 3.7-5.6 وحدة / مل (وهذا يتطلب تقدير نشاط الإنزيم للتخفيف باستخدام عدة مناسبات؛ إذا كان النشاط قد تم الإنزيم ليس واضحًا، ويمكن اختباره بشكل متكرر).

إنسايو:

1. ماصة 20 مل من محلول المحلول القابل للذوبان وحشوة 5 مل في أنبوب تدريب ومعايرة مسبقة وموازنتها في حوض ماء بدرجة حرارة ثابتة تصل إلى 60 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.

2. استخدم 1.00 مل من محلول الإنزيم المخفف الذي سيتعين عليك تحليله، وقم بتسجيل الوقت على الفور باستخدام كرونوميتر، وحرك جيدًا ورد الفعل بدقة لمدة 5 دقائق.

3. قم بسكب 1.00 مل من محلول التفاعل على الفور باستخدام ماصة، وقم بتسخينه في أنبوب اختبار مملوء بـ 0.5 مل من حمض الكلورهيدريك، و0.1 مول/لتر و5.00 مل من محلول اليود المخفف وحركه جيدًا.

4.استخدم مزيجًا من 0.5 مل من حمض الكلورهيدرات 0.1 مول/لتر و5.00 مل من محلول اليود المخفف كتفاعل أبيض وسريع الامتصاص (أ) بمكعب 10 مم بطول 660 نانومتر. بعد الامتصاص، راجع الملحق أ (بحث في معيار QB-T 1803-93)، واحصل على تركيز (C) من المحلول الإنزيمي.

تعريف النشاط الانزيمي:

1 مل من الإنزيم السائل، تليين أميد قابل للذوبان لمدة ساعة واحدة عند 60 درجة مئوية، الرقم الهيدروجيني = 6.0، هو وحدة نشاط إنزيمي، يتم التعبير عنها في U/mL.

حسابية:

X=C×n، X: النشاط الانزيمي للنسيج، C: تركيز الانزيم التجريبي، n: عامل تخفيف النسيج. يتم التعبير عن النتائج التي تم الحصول عليها من خلال أرقام معوية.

تحمل النتائج:

الخطأ النسبي للتجارب المتوازية لا يتجاوز 2%.