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Introducción del método de prueba de actividad enzimática de desencolado

Views: 0     Author: Site Editor     Publish Time: 2022-08-16      Origin: Site Inquire

principio:

La α-amilasa puede cortar al azar el enlace glucósido α-1,4 en la cadena del almidón en dextrina de cadena corta, una pequeña cantidad de maltosa y glucosa con diferentes longitudes, de modo que la reacción específica del almidón al yodo es azul-negra. el azul disminuyó gradualmente y gradualmente se convirtió en marrón rojizo. La velocidad de desaparición de su color estaba relacionada con la actividad enzimática, por lo que la actividad enzimática se podía calcular midiendo la absorbancia de la solución después de la reacción en condiciones estándar.


Reactivos y Soluciones:


Solución de yodo original: Pesar 22,0 g de yoduro de potasio y disolverlo en aproximadamente 300 ml de agua, agregar 11,0 g de yodo, disolverlo con agitación, luego transferirlo a un matraz volumétrico de 500 ml, enrasar con agua y almacenarlo en una botella marrón para su uso posterior (preparado una vez al mes).


Solución diluida de yodo: Pesar 20,0 g de yoduro de potasio y disolverlos en 300 mL de agua, agregar con precisión 2,00 mL de la solución original de yodo, transferir todo a un matraz aforado de 500 mL, enrasar con agua y almacenar en una botella marrón para su uso posterior (preparado una vez al mes).


Solución de almidón soluble de 20 g/L: Pese 2.000 g de solución de almidón soluble (en base seca), con una precisión de 0.001 g, haga una suspensión con agua, viértala lentamente en 70 mL de agua hirviendo con agitación y luego enjuague con 30 mL de agua varias veces En un vaso de precipitados pequeño que contiene almidón, se incorpora la loción, se calienta y se hierve durante 2 minutos hasta que esté completamente transparente, se enfría a temperatura ambiente, se transfiere a un matraz volumétrico de 100 ml y se diluye con agua hasta el enrase. Esta solución debe prepararse el mismo día.


Tampón fosfato (pH=6,0): Pesar 45,23 g de fosfato ácido disódico y 8,07 g de ácido cítrico, disolver en agua y diluir a 1000 mL. Después de mezclar, calibre con un medidor de pH.


Solución de ácido clorhídrico c(HCl)=0.1mol/L.


Instrumentos y Equipos:


Espectrofotómetro, baño de agua a temperatura constante 50 ℃-100 ℃, precisión ±0.1 ℃, tubo de ensayo: 25 mm × 200 mm, matraz volumétrico, pipeta automática, cronómetro.


Preparación de la solución enzimática a ensayar:


Preparación de enzima líquida: preparar directamente con solución tampón, de manera que la actividad de la enzima diluida esté en el rango de 3.7-5.6 U/mL (esto requiere la estimación de la actividad de la enzima para diluir a un múltiplo apropiado; si la actividad de la enzima no está clara, se puede probar repetidamente).


Ensayo:


1. Pipetear 20,0 ml de solución de almidón soluble y 5,0 ml de solución tampón en un tubo de ensayo y precalentar y equilibrar en un baño de agua a temperatura constante a 60 °C durante 5 minutos.

2. Agegue 1,00 ml de la solución de enzima diluida que se va a analizar, registre inmediatamente el tiempo con un cronómetro, agite bien y reaccione con precisión durante 5 minutos.

3. Inmediatamente succione 1,00 mL de la solución de reacción con una pipeta, caliéntelo en un tubo de ensayo precargado con 0,5 mL de ácido clorhídrico 0,1 mol/L y 5,00 mL de solución de yodo diluida y agite bien.

4.Utilice una mezcla de 0,5 mL de ácido clorhídrico 0,1 mol/L y 5,00 mL de solución de yodo diluida como blanco de reactivo y mida rápidamente la absorbancia (A) con una cubeta de 10 mm a una longitud de onda de 660 nm. Según la absorbancia, consulte el Apéndice A (búsqueda en el estándar QB-T 1803-93), y obtenga la concentración (C) de la solución enzimática.


Definición de actividad enzimática:


1mL de enzima líquida, licuefacción de almidón soluble por 1 hora a 60℃, pH=6.0, es una unidad de actividad enzimática, expresada en U/mL.


calcular:


X=C×n, X: la actividad enzimática de la muestra, C: la concentración de la enzima de prueba, n: el factor de dilución de la muestra. Los resultados obtenidos se expresan en números enteros.


Tolerancia de resultados:

El error relativo de los experimentos paralelos no supera el 2%.

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