Introdução ao método de teste de atividade enzimática desenvolvida

princípio:

A α-amilasa pode cortar para o azar o laço de glicose α-1,4 na cadeia do almidón em dextrina de cadeia curta, uma pequena quantidade de maltosa e glicose em diferentes longitudes, de modo que a reação específica do almidón ao iodo seja azul-negra. o azul diminuiu gradualmente e gradualmente se transformou em marrom vermelho. A velocidade de perda de cor estava relacionada à atividade enzimática, pois a atividade enzimática poderia calcular a absorção da solução após a reação nas condições padrão.

Reações e soluções:

Solução de iodo original: Pesar 22,0 g de iodo de potássio e dissolver em aproximadamente 300 ml de água, adicionar 11,0 g de iodo, dissolver com agitação, depois transferi-lo para uma matriz volumétrica de 500 ml, enxágue com água e armazene-o em uma garrafa marrom para seu uso posterior (preparado uma vez ao mês).

Solução diluída de iodo: Pesar 20,0 g de iodo de potássio e dissolvê-los em 300 mL de água, adicionar com precisão 2,00 mL da solução original de iodo, transferir tudo para uma matriz forrada de 500 mL, enxágue com água e armazene em uma garrafa marrom para uso posterior (preparada uma vez ao mês).

Solução de almidão solúvel de 20 g/L: Pese 2.000 g de solução de almidão solúvel (em base seca), com uma precisão de 0,001 g, faça uma suspensão com água, viértala lentamente em 70 mL de água, hirviendo com agitação e depois enjuague com 30 mL de água várias vezes Em um vaso de precipitados pequeno que contenha almidón, se incorpore a loção, se aqueça e se hierve durante 2 minutos até que esteja completamente transparente, se enfrie à temperatura ambiente, se transfira para um matraz volumétrico de 100 ml e se dilua com água até el enrase. Esta solução deve ser preparada no mesmo dia.

Tampão fosfato (pH=6,0): Pesar 45,23 g de fosfato ácido disódico e 8,07 g de ácido cítrico, dissolver em água e diluir em 1000 mL. Depois de mezclar, calibre com um medidor de pH.

Solução de ácido clorídrico c(HCl)=0,1mol/L.

Instrumentos e equipamentos:

Espectrofotômetro, banho de água com temperatura constante de 50 ℃-100 ℃, precisão ±0,1 ℃, tubo de ensaio: 25 mm × 200 mm, matraz volumétrico, pipeta automática, cronômetro.

Preparação da solução enzimática para ensaio:

Preparação de enzima líquida: prepare diretamente com solução tampão, de maneira que a atividade da enzima diluída esteja na faixa de 3,7-5,6 U/mL (isto requer a estimativa da atividade da enzima para diluir um apropiado múltiplo; se a atividade da enzima não for clara, você pode tentar repetidamente).

Ensaio:

1. Pipete 20,0 ml de solução de almidão solúvel e 5,0 ml de solução tampão em um tubo de ensaio e pré-calentar e equilibre em um banho de água a uma temperatura constante de 60 °C durante 5 minutos.

2. Agegue 1,00 ml da solução de enzima diluída que se vai analisar, registre imediatamente o tempo com um cronômetro, agite bem e reaja com precisão durante 5 minutos.

3. Aspire imediatamente 1,00 mL da solução de reação com uma pipeta, calibre-a em um tubo de ensaio pré-carregado com 0,5 mL de ácido clorídrico 0,1 mol/L e 5,00 mL de solução de iodo diluído e agite bem.

4.Utilize uma mistura de 0,5 mL de ácido clorídrico 0,1 mol/L e 5,00 mL de solução de iodo diluída como branco de reativo e mexa rapidamente a absorção (A) com uma cubeta de 10 mm e uma longitude de onda de 660 nm. Após a absorção, consulte o Apêndice A (busca no padrão QB-T 1803-93), e obtenha a concentração (C) da solução enzimática.

Definição de atividade enzimática:

1mL de enzima líquida, diluição de almidão solúvel por 1 hora a 60℃, pH=6,0, é uma unidade de atividade enzimática, expressa em U/mL.

calcular:

X=C×n, X: a atividade enzimática da mostra, C: a concentração da enzima de teste, n: o fator de diluição da mostra. Os resultados obtidos são expressos em números inteiros.

Tolerância de resultados:

O erro relativo aos experimentos paralelos não ultrapassa os 2%.