ما هي أنواع الأصباغ الفلورية التدفق؟

لتطوير قياس التدفق الخلوي، فإن القوة الدافعة الأكثر أهمية هي الأجسام المضادة، تليها الأصباغ الفلورية التي تتناسب مع قدرات الكشف للصك. لا تزال الأصباغ الفلورية غير قادرة على مواكبة عدد قنوات الكشف عن الأجهزة.

يمكن تقسيم الأصباغ الفلورية المتدفقة الموجودة إلى الفئات الـ 11 التالية:

1. الجزيئات العضوية الصغيرة

عندما يتعلق الأمر بالجزيئات العضوية الصغيرة، يجب أن يكون معظم الناس في حيرة من أمرهم، ولكن إذا أعطيت بعض الأمثلة، فسوف يتضح لي ذلك بالتأكيد.

FITC (389 دا)، Alexa Fluor 488 (FITC التناظرية، 643 Da)، Texas Red (TxRed، 625 Da)، Alexa Fluor 647 (1155 Da)، Pacific Blue (242 Da)، وCy5 (242 Da) 762 Da). هل يتم استخدامه بشكل أساسي؟

هذه الجزيئات العضوية الصغيرة لها طيف انبعاث ثابت وتحول ستوكس صغير (الفرق بين أطوال موجات الإثارة والانبعاث، حوالي 50-100 نانومتر)، وهي قابلة للضوء، ويمكن ربطها بسهولة بالأجسام المضادة، لذلك يتم استخدامها على نطاق واسع.

ومن الجدير بالذكر أن أصباغ Alexa Fluor أكثر ثباتًا للضوء من FITC، لذا إذا كنت تريد التصوير، فهي الخيار الأمثل.

2. فيكوبيليبروتين

Phycobiliproteins عبارة عن جزيئات بروتينية كبيرة مستخرجة من الطحالب مثل البكتيريا الزرقاء والدينوفلاجيلات. على سبيل المثال، يحتوي فيكوإيريترين (PE) على وزن جزيئي يبلغ 240.000 دا. تحتوي هذه البروتينات على تحولات ستوكس كبيرة (75-200 نانومتر) وأطياف انبعاث مستقرة. نظرًا لأن البروتينات الدهنية كبيرة الحجم، فإنها عادةً ما تحتوي على نسبة بروتين إلى فلوروكروم 1:1 أثناء الاقتران، مما يجعلها مفيدة لقياس التدفق الخلوي الكمي.

ومع ذلك، فإن البروتينات الدهنية عرضة للتبييض الضوئي، لذلك لا ينصح بالتعرض لفترات طويلة أو متكررة لمصادر ضوء الإثارة.

في عائلة فيكوبيليبروتين، بالإضافة إلى فيكويريثرين (PE)، هناك ألوفيكوسيانين (APC) وبروتين مومورديكا كلوروفيل (PerCP).

3. النقاط الكمومية

النقاط الكمومية (Qdots) عبارة عن بلورات نانوية لأشباه الموصلات ذات أطياف انبعاث مضان ترتبط ارتباطًا وثيقًا بحجم البلورات النانوية. من الأفضل تحفيزها بواسطة الأشعة فوق البنفسجية أو الضوء البنفسجي، ولكن من السهل أيضًا تحفيزها بواسطة أشعة ليزر أخرى بكميات صغيرة، لذلك عند استخدام Qdots في تجارب متعددة المعلمات، فإن هذا الإثارة الضئيلة لأطوال موجية أخرى من الليزر تؤدي إلى تعقيد تعويض التألق.

على هذا النحو، على الرغم من أن أصباغ النقاط الكمومية تتمتع بسطوع عالٍ، إلا أنه يتم استبدال هذه الكواشف في الغالب بأصباغ بوليمر في مخططات متعددة المعلمات بسبب استعصاء حل مشكلات التعويض هذه وصعوبة ربط Qdots بالأجسام المضادة.

4. أصباغ البوليمر

تتكون الأصباغ الجزيئية (البوليمر) من سلاسل بوليمر تجمع الإشارات الضوئية ويمكنها 'ضبط' امتصاص وانبعاث أطوال موجية محددة من الضوء، اعتمادًا على طول سلسلة البوليمر والوحدات الفرعية الجزيئية المرتبطة. هذه الأصباغ مستقرة جدًا ولها كفاءات كمية مشابهة للبروتينات النباتية مع ثبات ضوئي محسّن بشكل كبير.

نظرًا لأنه يمكن تصنيع أصباغ البوليمر لامتصاص أطوال موجية محددة فقط من الضوء، فقد تم تجنب مشكلة إثارة الطول الموجي المتقاطع لنقاط Qdots.

الممثلون النموذجيون لأصباغ البوليمر هم Brilliant Violet (BV) وBrilliant Ultraviolet (BUV) وBrilliant Blue (BB).

5. الأصباغ الترادفية

تقترن الأصباغ الترادفية كيميائيًا بالبروتينات النباتية (PE، APC، PerCP) أو الأصباغ الجزيئية الكبيرة (BV421، BUV395) مع الأصباغ الفلورية العضوية الصغيرة الجزيئية (Cy3، Cy5، Cy7)، وتستخدم نقل الطاقة الفلوري (FRET) لتشكيل ليزر واحد يتم إثارة المزيد من الأطوال الموجية للضوء المنبعث.

على سبيل المثال، الحد الأقصى لإثارة Texas Red هو 589 نانومتر، في حين أن انبعاث PE هو 585 نانومتر، لذلك من خلال اقتران PE مع Texas Red، فإن ضوء انبعاث PE يثير Texas Red من خلال FRET، مما يجعل PE-TxRed متاحًا عند 488 نانومتر أو 532 نانومتر إثارة ليزر.

يمكن أيضًا استخدام نفس الطريقة للأجسام المضادة البوليمرية جنبًا إلى جنب مع أصباغ الجزيئات العضوية الصغيرة.

الأصباغ الترادفية مشرقة جدًا ولها قيم تحول ستوكس كبيرة (150-300 نانومتر)، وهي مفيدة عند اكتشاف المستضدات منخفضة الكثافة. ومع ذلك، فإن الأصباغ الترادفية أقل استقرارًا من الفلوروتشرومات المانحة، وتختلف كفاءة نقل الطاقة من دفعة إلى أخرى، مما يعقد التعويض.

6. أيونات المعادن الثقيلة

أيونات المعادن الثقيلة ليست فلوريسئين بالمعنى الدقيق للكلمة، ولكننا نذكرها أيضًا هنا.

الأجسام المضادة المستخدمة في قياس الكتلة الخلوية لا تترافق مع الفلورسين، ولكنها تترافق مع أيونات المعادن الثقيلة من نظير واحد في سلسلة اللانثانيدات. يوجد حاليًا 35 نظيرًا من اللانثانيدات متاحة تجاريًا لاقتران الأجسام المضادة. هذه المجسات غير الفلورسنت ومناسبة فقط لقياس الخلايا الشامل.

7. البروتين الفلوري

كثيرا ما تستخدم البروتينات الفلورية كأنظمة مراسلة للتعبير الجيني. الأكثر استخدامًا هو البروتين الفلوري الأخضر (GFP) من Aequorea victoria. ومن هذا، يتم اشتقاق CFP وYFP.

بروتين الفلورسنت الأحمر (DsRed) مشتق من ديسكوزوما شقائق النعمان البحرية، والجيل القادم من بروتينات الفلورسنت الأحادية (mCherry، mBanana) مشتقة من DsRed ولها إثارة وأطياف انبعاث أوسع.

مع نضج تكنولوجيا استنساخ الجينات، هناك المئات من البروتينات الفلورية، التي يتراوح أطياف الإثارة والانبعاث بها من الأشعة فوق البنفسجية إلى الأشعة تحت الحمراء القريبة.

8. أصباغ الحمض النووي

تربط أصباغ الحمض النووي DNA أو RNA أو كليهما. يمكن استخدامها لقياس الحمض النووي لتحليل دورة الخلية (مثل PI، 7-AAD، DyeCycle Violet، DAPI)، وفرز الكروموسومات (مثل Hoescht 33342، Chromomycin A3)، وفرز الخلايا الجذعية باستخدام التحليل السكاني الجانبي (مثل Hoescht 33342)، ويتم التمييز بين الخلايا الحية والميتة ويتم فرز البكتيريا.

يمكن تحديد مستوى الانتشار من خلال الجمع بين أصباغ الحمض النووي مع تسمية أخرى، مثل صبغة الفلورسنت المترافقة المضادة للبروموديوكسيوريدين (BrdU).

9. تكاثر الخلايا بالأصباغ

يتم قياس تكاثر الخلايا عن طريق احتضان الخلايا باستخدام BrdU (بروموديوكسيوريدين)، والذي يتم دمجه في تخليق الحمض النووي الخلوي، ثم يتم تلوينه بالأجسام المضادة وأصباغ الحمض النووي الموجهة ضد BrdU. ومع ذلك، هذه الطريقة ليست مناسبة لدراسات الانتشار على المدى الطويل.

يمكن استخدام إستر كربوكسي فلوريسئين سوكسينيميديل (CFSE) لتتبع الانقسامات المتعددة للخلايا المتكاثرة. تتوفر الآن أيضًا أنواع مختلفة من أصباغ CFSE باللونين الأحمر والأرجواني. عند التركيزات المناسبة، لا تؤثر هذه الأصباغ على نمو الخلايا أو شكلها، مما يجعلها مناسبة لدراسات الانتشار على المدى الطويل.

10. صبغة موت الخلايا

يمكن تحديد بقاء الخلية عن طريق الأصباغ الاستبعادية (على سبيل المثال، يوديد البروبيديوم، DAPI) أو عن طريق ربط الأصباغ بالأمينات داخل الخلايا.

لا يمكن إصلاح أصباغ الاستبعاد وهي مناسبة فقط للخلايا غير المعدية والتي تتطلب تحليلاً فوريًا.

تعتبر الأصباغ الأمينية، بما في ذلك الحية/الميتة (ThermoFisher)، أو Zombie (Biolegend)، أو Fixable Viablity (BD Biosciences) مناسبة للخلايا الثابتة وبالتالي تلك التي تحتوي على خلايا معدية، والخلايا الملطخة بمستضدات داخل الخلايا، والخلايا المثبتة باستخدام بارافورمالدهيد.

11. صبغة مؤشر الكالسيوم

تخضع أصباغ مؤشر الكالسيوم لتغير اللون عند الارتباط بالكالسيوم ويمكن استخدامها للإشارة إلى التنشيط الخلوي والإشارات.

الصبغة الأكثر استخدامًا لا تزال هي indo-1، مسبار الكالسيوم ثنائي الطور للأشعة فوق البنفسجية. هناك أيضًا مجسات كالسيوم باللون الأزرق والأخضر للأنفلونزا 3.