¿Cuáles son los tipos de tintes fluorescentes de flujo?

Para el desarrollo de la citometría de flujo, la fuerza impulsora más importante son los anticuerpos, seguidos de los tintes fluorescentes que coinciden con las capacidades de detección del instrumento. Los tintes fluorescentes todavía no siguen el ritmo de la cantidad de canales de detección de instrumentos.

Los tintes fluorescentes de flujo existente se pueden dividir en las siguientes 11 categorías:

1. Pequeñas moléculas orgánicas

Cuando se trata de pequeñas moléculas orgánicas, la mayoría de la gente debe estar confundida, pero si doy algunos ejemplos, definitivamente me daré cuenta.

FITC (389 Da), Alexa Fluor 488 (análogo de FITC, 643 Da), Texas Red (TxRed, 625 Da), Alexa Fluor 647 (1155 Da), Pacific Blue (242 Da) y Cy5 (242 Da) 762 Da). ¿Se utiliza básicamente?

Estas pequeñas moléculas orgánicas tienen un espectro de emisión consistente y un pequeño desplazamiento de Stokes (diferencia entre las longitudes de onda de excitación y emisión, aproximadamente 50-100 nm), son fotoestables y se conjugan fácilmente con anticuerpos, por lo que se utilizan ampliamente.

Cabe mencionar que los tintes Alexa Fluor son más fotoestables que el FITC, por lo que si quieres tomar imágenes, son la elección.

2. Ficobiliproteína

Las ficobiliproteínas son grandes moléculas de proteínas extraídas de algas como las cianobacterias y los dinoflagelados. Por ejemplo, la ficoeritrina (PE) tiene un peso molecular de 240.000 Da. Estas proteínas tienen grandes desplazamientos de Stokes (75-200 nm) y espectros de emisión estables. Debido a que las ficobiliproteínas son grandes, normalmente tienen una proporción de proteína a fluorocromo de 1:1 durante la conjugación, lo que las hace útiles para la citometría de flujo cuantitativa.

Sin embargo, las ficobiliproteínas son susceptibles al fotoblanqueo, por lo que no se recomienda la exposición prolongada o repetida a fuentes de luz de excitación.

En la familia de las ficobiliproteínas, además de la ficoeritrina (PE), se encuentran la aloficocianina (APC) y la proteína clorofila Momordica (PerCP).

3. Puntos cuánticos

Los puntos cuánticos (Qdots) son nanocristales semiconductores con espectros de emisión de fluorescencia que están estrechamente relacionados con el tamaño de los nanocristales. Se excitan mejor con luz ultravioleta o violeta, pero también se excitan fácilmente con otros láseres en pequeñas cantidades, por lo que cuando se utilizan Qdots en experimentos multiparamétricos, esta pequeña excitación de otras longitudes de onda de láseres complica la compensación de fluorescencia.

Como tal, aunque los tintes de puntos cuánticos tienen un alto brillo, estos reactivos se reemplazan en su mayoría por tintes poliméricos en esquemas multiparamétricos debido a la intratabilidad de estos problemas de compensación y la dificultad de unir los Qdots a los anticuerpos.

4. Tintes poliméricos

Los tintes macromoleculares (polímeros) consisten en cadenas de polímeros que recogen señales luminosas y pueden 'sintonizar' la absorción y emisión de longitudes de onda de luz específicas, dependiendo de la longitud de la cadena del polímero y de las subunidades moleculares que están unidas. Estos tintes son muy estables y tienen eficiencias cuánticas similares a las ficobiliproteínas con una fotoestabilidad muy mejorada.

Dado que se puede hacer que los tintes poliméricos absorban sólo longitudes de onda de luz específicas, se evita el problema de la excitación de longitudes de onda cruzadas de los Qdots.

Los representantes típicos de los tintes poliméricos son Brilliant Violet (BV), Brilliant Ultraviolet (BUV) y Brilliant Blue (BB).

5. Tintes en tándem

Los tintes en tándem acoplan químicamente ficobiliproteínas (PE, APC, PerCP) o tintes macromoleculares (BV421, BUV395) con tintes fluorescentes orgánicos de molécula pequeña (Cy3, Cy5, Cy7) y utilizan la transferencia de energía de fluorescencia (FRET) para formar un único láser. Se excitan más longitudes de onda de luz emitida.

Por ejemplo, el máximo de excitación de Texas Red es 589 nm, mientras que la emisión de PE es 585 nm, por lo que al acoplar PE con Texas Red, la luz de emisión de PE excita Texas Red a través de FRET, lo que hace que PE-TxRed esté disponible a 488 nm o 532 nm de excitación láser.

El mismo método también se puede utilizar para anticuerpos poliméricos junto con colorantes orgánicos de moléculas pequeñas.

Los colorantes en tándem son muy brillantes y tienen valores de desplazamiento de Stokes grandes (150-300 nm), que son útiles para detectar antígenos de baja densidad. Sin embargo, los tintes en tándem son menos estables que los fluorocromos donantes y la eficiencia de la transferencia de energía varía de un lote a otro, lo que complica la compensación.

6. Iones de metales pesados

Los iones de metales pesados ​​no son estrictamente fluoresceína, pero también los mencionamos aquí.

Los anticuerpos utilizados en la citometría de masas no están conjugados con fluoresceína, sino con iones de metales pesados ​​de un solo isótopo de la serie de los lantánidos. Actualmente hay 35 isótopos de lantánidos disponibles comercialmente para la conjugación de anticuerpos. Estas sondas no son fluorescentes y sólo son adecuadas para citometría de masas.

7. Proteína fluorescente

Las proteínas fluorescentes se utilizan con frecuencia como sistemas indicadores para la expresión genética. La más utilizada es la proteína verde fluorescente (GFP) de Aequorea victoria. De aquí se derivan CFP y YFP.

La proteína fluorescente roja (DsRed) se deriva de la anémona de mar Discosoma, y ​​las proteínas fluorescentes monoméricas de próxima generación (mCherry, mBanana) se derivan de DsRed y tienen espectros de excitación y emisión más amplios.

Con la madurez de la tecnología de clonación de genes, existen cientos de proteínas fluorescentes, cuyos espectros de excitación y emisión van desde el ultravioleta hasta el infrarrojo cercano.

8. Tintes de ácidos nucleicos

Los colorantes de ácido nucleico se unen al ADN, al ARN o a ambos. Se pueden utilizar para cuantificar el ADN para el análisis del ciclo celular (p. ej., PI, 7-AAD, DyeCycle Violet, DAPI), clasificar cromosomas (p. ej., Hoescht 33342, cromomicina A3), clasificar células madre mediante análisis de población lateral (p. ej., Hoescht 33342), diferenciar células vivas y muertas y clasificar bacterias.

El nivel de proliferación se puede determinar combinando colorantes de ácidos nucleicos con otro marcador, como una antibromodesoxiuridina (BrdU) conjugada con un colorante fluorescente.

9. Tintes de proliferación celular.

La proliferación celular se mide incubando células con BrdU (bromodesoxiuridina), que se incorpora a la síntesis de ADN celular, y luego se tiñe con anticuerpos y colorantes de ADN dirigidos contra BrdU. Sin embargo, este método no es adecuado para estudios de proliferación a largo plazo.

El éster succinimidílico de carboxifluoresceína (CFSE) se puede utilizar para rastrear múltiples divisiones de células en proliferación. Ahora también están disponibles variantes rojas y moradas de los tintes CFSE. En concentraciones adecuadas, estos tintes no afectan el crecimiento ni la morfología celular, lo que los hace adecuados para estudios de proliferación a largo plazo.

10. Tinte de muerte celular

La viabilidad celular se puede determinar mediante colorantes de exclusión (p. ej., yoduro de propidio, DAPI) o mediante la unión de colorantes a aminas intracelulares.

Los colorantes de exclusión no se pueden fijar y sólo son adecuados para células que no son infecciosas y requieren un análisis inmediato.

Los colorantes de amina, incluidos Live/Dead (ThermoFisher), Zombie (Biolegend) o Fixable Viablity (BD Biosciences), son adecuados para células fijadas y, por lo tanto, para aquellas con células infecciosas, células teñidas con antígenos intracelulares y células fijadas con paraformaldehído.

11. Colorante indicador de calcio

Los colorantes indicadores de calcio experimentan un cambio de color al unirse al calcio y pueden usarse para indicar activación y señalización celular.

El colorante más utilizado sigue siendo el indo-1, la sonda de calcio bifásica UV. También existen sondas de calcio azul-verde para fluo-3.