Các loại thuốc nhuộm huỳnh quang dòng chảy là gì?

Để phát triển phương pháp tế bào học dòng chảy, động lực quan trọng nhất là kháng thể, tiếp theo là thuốc nhuộm huỳnh quang phù hợp với khả năng phát hiện của thiết bị. Thuốc nhuộm huỳnh quang vẫn không theo kịp số lượng kênh phát hiện dụng cụ.

Thuốc nhuộm huỳnh quang dòng chảy hiện có có thể được chia thành 11 loại sau:

1. Phân tử hữu cơ nhỏ

Khi nói đến các phân tử hữu cơ nhỏ, chắc hẳn hầu hết mọi người đều bối rối, nhưng nếu tôi đưa ra một vài ví dụ thì chắc chắn tôi sẽ hiểu ra.

FITC (389 Da), Alexa Fluor 488 (FITC analog, 643 Da), Texas Red (TxRed, 625 Da), Alexa Fluor 647 (1155 Da), Pacific Blue (242 Da) và Cy5 (242 Da) 762 Da). Về cơ bản nó có được sử dụng không?

Những phân tử hữu cơ nhỏ này có phổ phát xạ ổn định và độ dịch chuyển Stokes nhỏ (chênh lệch giữa bước sóng kích thích và bước sóng phát xạ, khoảng 50-100 nm), có khả năng quang hóa và dễ dàng liên hợp với kháng thể nên chúng được sử dụng rộng rãi.

Điều đáng nói là thuốc nhuộm Alexa Fluor có khả năng quang hóa cao hơn FITC, vì vậy nếu bạn muốn chụp ảnh thì chúng là sự lựa chọn.

2. Phycobiliprotein

Phycobiliprotein là các phân tử protein lớn được chiết xuất từ ​​tảo như vi khuẩn lam và dinoflagellate. Ví dụ, phycoerythrin (PE) có trọng lượng phân tử 240.000 Da. Những protein này có độ dịch chuyển Stokes lớn (75-200 nm) và phổ phát xạ ổn định. Bởi vì phycobiliprotein có kích thước lớn nên chúng thường có tỷ lệ protein và fluorochrome là 1:1 trong quá trình liên hợp, khiến chúng hữu ích cho phép đo tế bào dòng chảy định lượng.

Tuy nhiên, phycobiliprotein dễ bị tẩy trắng bằng ánh sáng, do đó không nên tiếp xúc kéo dài hoặc lặp đi lặp lại với các nguồn sáng kích thích.

Trong họ phycobiliprotein, ngoài phycoerythrin (PE), còn có allophycocyanin (APC) và protein diệp lục Momordica (PerCP).

3. Chấm lượng tử

Chấm lượng tử (Qdots) là các tinh thể nano bán dẫn có phổ phát xạ huỳnh quang có liên quan chặt chẽ đến kích thước của tinh thể nano. Chúng bị kích thích tốt nhất bởi ánh sáng cực tím hoặc tím, nhưng cũng dễ dàng bị kích thích bởi các tia laser khác với lượng nhỏ, vì vậy khi sử dụng Qdots trong các thí nghiệm đa thông số, sự kích thích nhỏ này của các bước sóng khác của laser sẽ làm phức tạp quá trình bù huỳnh quang.

Do đó, mặc dù thuốc nhuộm chấm lượng tử có độ sáng cao nhưng các thuốc thử này hầu hết được thay thế bằng thuốc nhuộm polymer trong sơ đồ đa thông số do tính khó khắc phục của các vấn đề bù này và khó liên kết Qdots với kháng thể.

4. Thuốc nhuộm polyme

Thuốc nhuộm cao phân tử (polymer) bao gồm các chuỗi polymer thu thập tín hiệu ánh sáng và có thể 'điều chỉnh' sự hấp thụ và phát xạ của các bước sóng ánh sáng cụ thể, tùy thuộc vào độ dài của chuỗi polymer và các tiểu đơn vị phân tử được gắn vào. Những thuốc nhuộm này rất ổn định và có hiệu suất lượng tử tương tự như phycobiliprotein với khả năng ổn định quang học được cải thiện đáng kể.

Vì thuốc nhuộm polyme có thể được chế tạo để chỉ hấp thụ các bước sóng ánh sáng cụ thể nên tránh được vấn đề kích thích bước sóng chéo của Qdots.

Đại diện tiêu biểu của thuốc nhuộm polyme là Brilliant Violet (BV), Brilliant Ultraviolet (BUV) và Brilliant Blue (BB).

5. Thuốc nhuộm song song

Thuốc nhuộm song song kết hợp hóa học với phycobiliprotein (PE, APC, PerCP) hoặc thuốc nhuộm cao phân tử (BV421, BUV395) với thuốc nhuộm huỳnh quang phân tử nhỏ hữu cơ (Cy3, Cy5, Cy7) và sử dụng sự truyền năng lượng huỳnh quang (FRET) để tạo thành một tia laser có nhiều bước sóng hơn của ánh sáng phát ra bị kích thích.

Ví dụ, mức kích thích tối đa của Texas Red là 589 nm, trong khi sự phát xạ của PE là 585 nm, do đó, bằng cách ghép PE với Texas Red, ánh sáng phát xạ của PE kích thích Texas Red thông qua FRET, do đó làm cho PE-TxRed có sẵn ở bước sóng kích thích bằng Laser 488 nm hoặc 532 nm.

Phương pháp tương tự cũng có thể được sử dụng cho các kháng thể polyme song song với thuốc nhuộm phân tử hữu cơ nhỏ.

Thuốc nhuộm song song rất sáng và có giá trị dịch chuyển Stokes lớn (150-300 nm), rất hữu ích khi phát hiện các kháng nguyên mật độ thấp. Tuy nhiên, thuốc nhuộm song song kém ổn định hơn so với thuốc nhuộm fluorochrome của nhà tài trợ và hiệu suất truyền năng lượng thay đổi theo từng lô, khiến việc bù đắp trở nên phức tạp.

6. Ion kim loại nặng

Nói đúng ra thì các ion kim loại nặng không phải là fluorescein, nhưng chúng tôi cũng đề cập đến chúng ở đây.

Các kháng thể được sử dụng trong phép đo tế bào khối không được liên hợp với fluorescein mà được liên hợp với các ion kim loại nặng của một đồng vị duy nhất trong chuỗi lanthanide. Hiện nay có 35 đồng vị lanthanide được bán trên thị trường để liên hợp kháng thể. Những đầu dò này không có huỳnh quang và chỉ thích hợp cho phép đo tế bào khối lượng.

7. Protein huỳnh quang

Protein huỳnh quang thường được sử dụng làm hệ thống báo cáo biểu hiện gen. Loại được sử dụng phổ biến nhất là protein huỳnh quang màu xanh lá cây (GFP) từ Aequorea victoria. Từ đó, CFP và YFP được rút ra.

Protein huỳnh quang màu đỏ (DsRed) có nguồn gốc từ nấm hải quỳ Discosoma và protein huỳnh quang đơn phân thế hệ tiếp theo (mCherry, mBanana) có nguồn gốc từ DsRed và có phổ kích thích và phát xạ rộng hơn.

Với sự trưởng thành của công nghệ nhân bản gen, có hàng trăm protein huỳnh quang có phổ kích thích và phát xạ từ tia cực tím đến cận hồng ngoại.

8. Thuốc nhuộm axit nucleic

Thuốc nhuộm axit nucleic liên kết DNA, RNA hoặc cả hai. Chúng có thể được sử dụng để định lượng DNA để phân tích chu kỳ tế bào (ví dụ PI, 7-AAD, DyeCycle Violet, DAPI), phân loại nhiễm sắc thể (ví dụ Hoescht 33342, Chromomycin A3), phân loại tế bào gốc bằng phân tích quần thể phụ (ví dụ Hoescht 33342), tế bào sống và tế bào chết được phân biệt và vi khuẩn được phân loại.

Mức độ tăng sinh có thể được xác định bằng cách kết hợp thuốc nhuộm axit nucleic với một chất đánh dấu khác, chẳng hạn như chất chống bromodeoxyuridine liên hợp thuốc nhuộm huỳnh quang (BrdU).

9. Thuốc nhuộm tăng sinh tế bào

Sự tăng sinh tế bào được đo bằng cách ủ tế bào với BrdU (bromodeoxyuridine), chất này được tích hợp vào quá trình tổng hợp DNA của tế bào, sau đó nhuộm màu bằng kháng thể và thuốc nhuộm DNA chống lại BrdU. Tuy nhiên, phương pháp này không phù hợp cho các nghiên cứu tăng sinh dài hạn.

Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) có thể được sử dụng để theo dõi nhiều quá trình phân chia của các tế bào đang tăng sinh. Các biến thể màu đỏ và tím của thuốc nhuộm CFSE hiện cũng có sẵn. Ở nồng độ thích hợp, các thuốc nhuộm này không ảnh hưởng đến sự phát triển hoặc hình thái tế bào, khiến chúng phù hợp cho các nghiên cứu tăng sinh dài hạn.

10. Thuốc nhuộm chết tế bào

Khả năng sống của tế bào có thể được xác định bằng thuốc nhuộm loại trừ (ví dụ propidium iodide, DAPI) hoặc bằng cách liên kết thuốc nhuộm với các amin nội bào.

Thuốc nhuộm loại trừ không thể cố định và chỉ phù hợp với các tế bào không có khả năng lây nhiễm và cần phân tích ngay lập tức.

Thuốc nhuộm amin bao gồm Live/Dead (ThermoFisher), Zombie (Biolegend) hoặc Fixable Viblity (BD Biosciences) phù hợp cho các tế bào cố định và do đó những tế bào có tế bào truyền nhiễm, tế bào được nhuộm bằng kháng nguyên nội bào, tế bào được cố định bằng paraformaldehyde.

11. Thuốc nhuộm chỉ thị canxi

Thuốc nhuộm chỉ thị canxi trải qua sự thay đổi màu sắc khi liên kết với canxi và có thể được sử dụng để biểu thị sự kích hoạt và truyền tín hiệu của tế bào.

Thuốc nhuộm được sử dụng phổ biến nhất vẫn là indo-1, đầu dò canxi hai pha UV. Ngoài ra còn có đầu dò canxi màu xanh lam cho fluo-3.