Welche Arten von Flussfluoreszenzfarbstoffen gibt es?

Für die Entwicklung der Durchflusszytometrie sind Antikörper die wichtigste treibende Kraft, gefolgt von Fluoreszenzfarbstoffen, die den Nachweisfähigkeiten des Instruments entsprechen. Fluoreszierende Farbstoffe halten immer noch nicht mit der Anzahl der Detektionskanäle der Instrumente Schritt.

Bestehende Durchfluss-Fluoreszenzfarbstoffe können in die folgenden 11 Kategorien unterteilt werden:

1. Kleine organische Moleküle

Wenn es um kleine organische Moleküle geht, müssen die meisten Menschen verwirrt sein, aber wenn ich ein paar Beispiele nenne, wird es mir definitiv klar.

FITC (389 Da), Alexa Fluor 488 (FITC-Analog, 643 Da), Texas Red (TxRed, 625 Da), Alexa Fluor 647 (1155 Da), Pacific Blue (242 Da) und Cy5 (242 Da) 762 Da). Wird es grundsätzlich verwendet?

Diese kleinen organischen Moleküle haben ein konsistentes Emissionsspektrum und eine kleine Stokes-Verschiebung (Unterschied zwischen Anregungs- und Emissionswellenlänge, etwa 50–100 nm), sind photostabil und lassen sich leicht an Antikörper konjugieren, weshalb sie weit verbreitet sind.

Es ist erwähnenswert, dass Alexa Fluor-Farbstoffe fotostabiler sind als FITC. Wenn Sie also Bilder erstellen möchten, sind sie die erste Wahl.

2. Phycobiliprotein

Phycobiliproteine ​​sind große Proteinmoleküle, die aus Algen wie Cyanobakterien und Dinoflagellaten gewonnen werden. Phycoerythrin (PE) hat beispielsweise ein Molekulargewicht von 240.000 Da. Diese Proteine ​​​​haben große Stokes-Verschiebungen (75–200 nm) und stabile Emissionsspektren. Da Phycobiliproteine ​​groß sind, weisen sie während der Konjugation typischerweise ein Verhältnis von Protein zu Fluorochrom von 1:1 auf, was sie für die quantitative Durchflusszytometrie nützlich macht.

Da Phycobiliproteine ​​jedoch anfällig für Photobleichung sind, wird eine längere oder wiederholte Exposition gegenüber Anregungslichtquellen nicht empfohlen.

In der Phycobiliprotein-Familie gibt es neben Phycoerythrin (PE) Allophycocyanin (APC) und Momordica-Chlorophyll-Protein (PerCP).

3. Quantenpunkte

Quantenpunkte (Qdots) sind Halbleiter-Nanokristalle mit Fluoreszenzemissionsspektren, die eng mit der Größe der Nanokristalle zusammenhängen. Sie werden am besten durch ultraviolettes oder violettes Licht angeregt, können aber auch leicht durch andere Laser in kleinen Mengen angeregt werden. Wenn Qdots in Multiparameter-Experimenten verwendet werden, erschwert diese winzige Anregung anderer Laserwellenlängen die Fluoreszenzkompensation.

Obwohl Quantenpunktfarbstoffe eine hohe Helligkeit aufweisen, werden diese Reagenzien in Multiparameterschemata aufgrund der Unlösbarkeit dieser Kompensationsprobleme und der Schwierigkeit, Qdots an Antikörper zu binden, meist durch Polymerfarbstoffe ersetzt.

4. Polymerfarbstoffe

Makromolekulare (Polymer-)Farbstoffe bestehen aus Polymerketten, die Lichtsignale sammeln und die Absorption und Emission bestimmter Lichtwellenlängen „abstimmen“ können, abhängig von der Länge der Polymerkette und den daran befestigten molekularen Untereinheiten. Diese Farbstoffe sind sehr stabil und haben ähnliche Quanteneffizienzen wie Phycobiliproteine ​​mit deutlich verbesserter Photostabilität.

Da die Polymerfarbstoffe nur bestimmte Lichtwellenlängen absorbieren können, wird das Problem der Anregung von Q-Punkten über die Wellenlänge hinweg vermieden.

Typische Vertreter der Polymerfarbstoffe sind Brilliant Violet (BV), Brilliant Ultraviolet (BUV) und Brilliant Blue (BB).

5. Tandem-Färbungen

Tandemfarbstoffe koppeln chemisch Phycobiliproteine ​​(PE, APC, PerCP) oder makromolekulare Farbstoffe (BV421, BUV395) mit organischen, niedermolekularen Fluoreszenzfarbstoffen (Cy3, Cy5, Cy7) und nutzen Fluoreszenzenergietransfer (FRET), um einen einzelnen Laser zu bilden. Es werden mehrere Wellenlängen des emittierten Lichts angeregt.

Beispielsweise beträgt das Anregungsmaximum von Texas Red 589 nm, während die Emission von PE 585 nm beträgt. Durch die Kopplung von PE mit Texas Red regt das Emissionslicht von PE Texas Red über FRET an, wodurch PE-TxRed bei 488 nm oder 532 nm Laseranregung verfügbar wird.

Die gleiche Methode kann auch für Polymerantikörper in Kombination mit organischen Farbstoffen kleiner Moleküle verwendet werden.

Tandemfarbstoffe sind sehr hell und haben große Stokes-Verschiebungswerte (150–300 nm), die beim Nachweis von Antigenen niedriger Dichte nützlich sind. Allerdings sind Tandemfarbstoffe weniger stabil als Donor-Fluorochrome und die Effizienz der Energieübertragung variiert von Charge zu Charge, was die Kompensation erschwert.

6. Schwermetallionen

Bei Schwermetallionen handelt es sich streng genommen nicht um Fluorescein, wir erwähnen sie hier aber auch.

In der Massenzytometrie verwendete Antikörper sind nicht mit Fluorescein konjugiert, sondern mit Schwermetallionen eines einzelnen Isotops der Lanthanoidenreihe. Derzeit sind 35 Lanthanoid-Isotope für die Antikörperkonjugation kommerziell erhältlich. Diese Sonden sind nicht fluoreszierend und nur für die Massenzytometrie geeignet.

7. Fluoreszierendes Protein

Fluoreszierende Proteine ​​werden häufig als Reportersysteme für die Genexpression verwendet. Am häufigsten wird das grün fluoreszierende Protein (GFP) aus Aequorea victoria verwendet. Daraus leiten sich CFP und YFP ab.

Das rot fluoreszierende Protein (DsRed) wird aus der Pilzseeanemone Discosoma gewonnen, und die monomeren fluoreszierenden Proteine ​​der nächsten Generation (mCherry, mBanana) werden aus DsRed gewonnen und weisen breitere Anregungs- und Emissionsspektren auf.

Mit der Reife der Genklonierungstechnologie gibt es Hunderte von fluoreszierenden Proteinen, deren Anregungs- und Emissionsspektren vom Ultravioletten bis zum nahen Infrarot reichen.

8. Nukleinsäurefarbstoffe

Nukleinsäurefarbstoffe binden DNA, RNA oder beides. Sie können verwendet werden, um DNA für die Zellzyklusanalyse zu quantifizieren (z. B. PI, 7-AAD, DyeCycle Violet, DAPI), Chromosomen zu sortieren (z. B. Hoescht 33342, Chromomycin A3), Stammzellen mittels Nebenpopulationsanalyse zu sortieren (z. B. Hoescht 33342), lebende und tote Zellen zu unterscheiden und Bakterien zu sortieren.

Der Grad der Proliferation kann durch die Kombination von Nukleinsäurefarbstoffen mit einer anderen Markierung, beispielsweise einem mit einem Fluoreszenzfarbstoff konjugierten Anti-Bromdeoxyuridin (BrdU), bestimmt werden.

9. Zellproliferationsfarbstoffe

Die Zellproliferation wird gemessen, indem Zellen mit BrdU (Bromdesoxyuridin) inkubiert werden, das in die zelluläre DNA-Synthese eingebaut wird, und dann mit gegen BrdU gerichteten Antikörpern und DNA-Farbstoffen angefärbt werden. Für langfristige Proliferationsstudien ist diese Methode jedoch nicht geeignet.

Carboxyfluorescein-Succinimidylester (CFSE) kann verwendet werden, um mehrere Teilungen proliferierender Zellen zu verfolgen. Ab sofort sind auch rote und violette Varianten der CFSE-Farbstoffe erhältlich. Bei geeigneten Konzentrationen beeinflussen diese Farbstoffe weder das Zellwachstum noch die Morphologie und eignen sich daher für Langzeitstudien zur Proliferation.

10. Zelltod-Farbstoff

Die Lebensfähigkeit der Zellen kann durch Ausschlussfarbstoffe (z. B. Propidiumiodid, DAPI) oder durch die Bindung von Farbstoffen an intrazelluläre Amine bestimmt werden.

Ausschlussfarbstoffe können nicht fixiert werden und sind nur für Zellen geeignet, die nicht infektiös sind und eine sofortige Analyse erfordern.

Aminfarbstoffe wie Live/Dead (ThermoFisher), Zombie (Biolegend) oder Fixable Viablity (BD Biosciences) eignen sich für fixierte Zellen und daher für solche mit infektiösen Zellen, mit intrazellulären Antigenen gefärbten Zellen und mit Paraformaldehyd fixierten Zellen.

11. Calcium-Indikatorfarbstoff

Calcium-Indikatorfarbstoffe unterliegen bei der Bindung an Calcium einer Farbverschiebung und können zur Anzeige der zellulären Aktivierung und Signalübertragung verwendet werden.

Der am häufigsten verwendete Farbstoff ist nach wie vor Indo-1, die UV-biphasische Calciumsonde. Es gibt auch blaugrüne Kalziumsonden für Fluo-3.