انواع رنگ های فلورسنت جریان چیست؟

برای توسعه فلوسایتومتری، مهم ترین نیروی محرکه آنتی بادی ها و به دنبال آن رنگ های فلورسنت هستند که با قابلیت های تشخیص دستگاه مطابقت دارند. رنگ های فلورسنت هنوز با تعداد کانال های تشخیص ابزار هماهنگ نیستند.

رنگ های فلورسنت جریان عبوری موجود را می توان به 11 دسته زیر تقسیم کرد:

1. مولکول های آلی کوچک

وقتی صحبت از مولکول‌های آلی کوچک می‌شود، بیشتر مردم باید گیج شوند، اما اگر چند مثال بزنم، قطعاً برایم روشن می‌شود.

FITC (389 دا)، الکسا فلور 488 (آنالوگ FITC، 643 دا)، تگزاس قرمز (TxRed، 625 دا)، الکسا فلور 647 (1155 دا)، آبی اقیانوس آرام (242 دا)، و Cy5 (242 دا) 762 دا). آیا اساسا استفاده می شود؟

این مولکول‌های آلی کوچک دارای طیف انتشار ثابت و شیفت استوکس کوچک (تفاوت بین طول موج تحریک و انتشار، تقریباً 50 تا 100 نانومتر)، مقاوم در برابر نور هستند و به راحتی با آنتی‌بادی‌ها کونژوگه می‌شوند، بنابراین به طور گسترده مورد استفاده قرار می‌گیرند.

شایان ذکر است که رنگ های فلور الکسا نسبت به FITC پایدارتر از عکس هستند، بنابراین اگر می خواهید تصویربرداری کنید، آنها انتخاب هستند.

2. فیکوبیلیپروتئین

فیکوبیلیپروتئین ها مولکول های پروتئینی بزرگی هستند که از جلبک هایی مانند سیانوباکتری ها و دینوفلاژلات ها استخراج می شوند. به عنوان مثال، فیکواریترین (PE) دارای وزن مولکولی 240000 Da است. این پروتئین ها دارای شیفت های بزرگ استوکس (75-200 نانومتر) و طیف انتشار پایدار هستند. از آنجایی که فیکوبیلیپروتئین ها بزرگ هستند، معمولاً نسبت پروتئین به فلوئوروکروم 1: 1 در طول کونژوگه دارند که آنها را برای فلوسیتومتری کمی مفید می کند.

با این حال، فیکوبیلیپروتئین ها مستعد سفید شدن نور هستند، بنابراین قرار گرفتن طولانی مدت یا مکرر در معرض منابع نور تحریک کننده توصیه نمی شود.

در خانواده فیکوبیلیپروتئین ها، علاوه بر فیکواریترین (PE)، آلوفیکوسیانین (APC) و پروتئین کلروفیل مومودیکا (PerCP) وجود دارد.

3. نقاط کوانتومی

نقاط کوانتومی (Qdots) نانوبلورهای نیمه رسانا با طیف نشر فلورسانس هستند که ارتباط نزدیکی با اندازه نانوبلورها دارند. آنها به بهترین وجه توسط نور فرابنفش یا بنفش برانگیخته می شوند، اما همچنین به راحتی توسط لیزرهای دیگر در مقادیر کم تحریک می شوند، بنابراین هنگام استفاده از Qdots در آزمایش های چند پارامتری، این تحریک کوچک سایر طول موج های لیزر، جبران فلورسانس را پیچیده می کند.

به این ترتیب، اگرچه رنگ‌های نقطه کوانتومی روشنایی بالایی دارند، اما این معرف‌ها عمدتاً با رنگ‌های پلیمری در طرح‌های چند پارامتری جایگزین می‌شوند، زیرا این مشکلات جبران‌ناپذیری و دشواری اتصال Qdots به آنتی‌بادی‌ها است.

4. رنگ های پلیمری

رنگ‌های ماکرومولکولی (پلیمر) از زنجیره‌های پلیمری تشکیل شده‌اند که سیگنال‌های نوری را جمع‌آوری می‌کنند و بسته به طول زنجیره پلیمری و زیر واحدهای مولکولی متصل شده، می‌توانند جذب و انتشار طول‌موج‌های خاص نور را تنظیم کنند. این رنگ‌ها بسیار پایدار هستند و کارایی کوانتومی مشابه فیکوبیلی‌پروتئین‌ها با پایداری نوری بسیار بهبود یافته دارند.

از آنجایی که رنگ‌های پلیمری می‌توانند فقط طول موج‌های خاصی از نور را جذب کنند، از مشکل تحریک طول موج متقاطع Qdots جلوگیری می‌شود.

نمایندگان معمولی رنگ های پلیمری عبارتند از: بنفش درخشان (BV)، فرابنفش درخشان (BUV) و آبی درخشان (BB).

5. رنگ های پشت سر هم

رنگ‌های پشت سر هم فیکوبیلی‌پروتئین‌ها (PE، APC، PerCP) یا رنگ‌های ماکرومولکولی (BV421، BUV395) را با رنگ‌های فلورسنت مولکولی کوچک آلی (Cy3، Cy5، Cy7) ترکیب می‌کنند و از انتقال انرژی فلورسانس (FRET) برای تشکیل یک لیزر منفرد با امواج نور استفاده می‌کنند.

به عنوان مثال، حداکثر تحریک تگزاس رد 589 نانومتر است، در حالی که گسیل PE 585 نانومتر است، بنابراین با جفت کردن PE با قرمز تگزاس، نور تابشی PE تگزاس قرمز را از طریق FRET تحریک می کند، بنابراین PE-TxRed در تحریک لیزری 488 نانومتر یا 532 نانومتر در دسترس قرار می گیرد.

همین روش همچنین می تواند برای آنتی بادی های پلیمری در پشت سر هم با رنگ های مولکولی کوچک آلی استفاده شود.

رنگ های پشت سر هم بسیار روشن هستند و دارای مقادیر شیفت استوکس بزرگ (150-300 نانومتر) هستند که در تشخیص آنتی ژن های با چگالی کم مفید هستند. با این حال، رنگ‌های پشت سر هم نسبت به فلوروکروم‌های اهداکننده پایداری کمتری دارند و راندمان انتقال انرژی از دسته‌ای به دسته دیگر متفاوت است و جبران را پیچیده می‌کند.

6. یون های فلزات سنگین

یون های فلزات سنگین به طور دقیق فلورسین نیستند، اما ما در اینجا به آنها نیز اشاره می کنیم.

آنتی بادی های مورد استفاده در سیتومتری جرمی با فلورسین کونژوگه نمی شوند، اما به یون های فلزات سنگین یک ایزوتوپ منفرد در سری لانتانید کونژوگه می شوند. در حال حاضر 35 ایزوتوپ لانتانید به صورت تجاری برای کونژوگاسیون آنتی بادی موجود است. این پروب ها غیر فلورسنت هستند و فقط برای سیتومتری جرمی مناسب هستند.

7. پروتئین فلورسنت

پروتئین های فلورسنت اغلب به عنوان سیستم های گزارشگر برای بیان ژن استفاده می شوند. متداول ترین پروتئین فلورسنت سبز (GFP) از Aequorea victoria است. از این، CFP و YFP مشتق می شوند.

پروتئین فلورسنت قرمز (DsRed) از شقایق دریایی قارچی Discosoma مشتق شده است، و نسل بعدی پروتئین‌های فلورسنت مونومر (mCherry، mBanana) از DsRed مشتق شده‌اند و طیف‌های تحریک و انتشار گسترده‌تری دارند.

با بلوغ فناوری شبیه سازی ژن، صدها پروتئین فلورسنت وجود دارد که طیف تحریک و انتشار آنها از ماوراء بنفش تا مادون قرمز نزدیک است.

8. رنگهای اسید نوکلئیک

رنگهای اسید نوکلئیک به DNA، RNA یا هر دو متصل می شوند. آنها را می توان برای تعیین کمیت DNA برای تجزیه و تحلیل چرخه سلولی (به عنوان مثال PI، 7-AAD، DyeCycle Violet، DAPI)، مرتب سازی کروموزوم ها (به عنوان مثال Hoescht 33342، کرومومایسین A3)، مرتب سازی سلول های بنیادی با استفاده از تجزیه و تحلیل جمعیت جانبی (مانند Hoescht 33342)، سلول های زنده و مرده جدا شده استفاده کرد.

سطح تکثیر را می‌توان با ترکیب رنگ‌های اسید نوکلئیک با برچسب دیگری، مانند یک رنگ فلورسنت ضد برمودئوکسی‌اوریدین (BrdU) تعیین کرد.

9. رنگ های تکثیر سلولی

تکثیر سلولی با انکوباسیون سلول‌ها با BrdU (برومودئوکسی‌اوریدین)، که در سنتز DNA سلولی گنجانده می‌شود، اندازه‌گیری می‌شود و سپس با آنتی‌بادی‌ها و رنگ‌های DNA که علیه BrdU هستند رنگ‌آمیزی می‌شود. با این حال، این روش برای مطالعات طولانی مدت تکثیر مناسب نیست.

کربوکسی فلورسئین سوکسینیمیدیل استر (CFSE) می تواند برای ردیابی تقسیمات متعدد سلول های در حال تکثیر استفاده شود. انواع قرمز و بنفش رنگ های CFSE نیز اکنون در دسترس هستند. در غلظت‌های مناسب، این رنگ‌ها بر رشد یا مورفولوژی سلولی تأثیر نمی‌گذارند و برای مطالعات تکثیر طولانی‌مدت مناسب هستند.

10. رنگ مرگ سلولی

زنده ماندن سلول را می توان با رنگ های حذف (مثلاً یدید پروپیدیوم، DAPI) یا با اتصال رنگ ها به آمین های داخل سلولی تعیین کرد.

رنگ های خروجی قابل تثبیت نیستند و فقط برای سلول هایی مناسب هستند که عفونی نیستند و نیاز به تجزیه و تحلیل فوری دارند.

رنگ‌های آمینی شامل Live/Dead (ThermoFisher)، Zombie (Biolegend) یا Fixable Viablity (BD Biosciences) برای سلول‌های ثابت و در نتیجه آنهایی که دارای سلول‌های عفونی هستند، سلول‌های رنگ‌شده با آنتی‌ژن‌های داخل سلولی، سلول‌های تثبیت شده با پارافورمالدئید مناسب هستند.

11. رنگ شاخص کلسیم

رنگ های شاخص کلسیم پس از اتصال به کلسیم دچار تغییر رنگ می شوند و می توانند برای نشان دادن فعال سازی و سیگنال دهی سلولی استفاده شوند.

رایج ترین رنگ مورد استفاده هنوز هم ایندو-1، پروب کلسیم دوفازی UV است. همچنین پروب های کلسیم آبی-سبز برای fluo-3 وجود دارد.