Какие существуют типы проточных флуоресцентных красителей?

Для развития проточной цитометрии наиболее важной движущей силой являются антитела, за которыми следуют флуоресцентные красители, соответствующие возможностям обнаружения прибора. Флуоресцентные красители пока не поспевают за количеством каналов детектирования приборов.

Существующие проточные флуоресцентные красители можно разделить на следующие 11 категорий:

1. Маленькие органические молекулы

Когда речь идет о небольших органических молекулах, большинство людей, должно быть, запутались, но если я приведу несколько примеров, меня обязательно осенит.

FITC (389 Да), Alexa Fluor 488 (аналог FITC, 643 Да), Texas Red (TxRed, 625 Да), Alexa Fluor 647 (1155 Да), Pacific Blue (242 Да) и Cy5 (242 Да) 762 Да). Он в принципе используется?

Эти небольшие органические молекулы имеют постоянный спектр излучения и небольшой стоксов сдвиг (разница между длинами волн возбуждения и излучения примерно 50–100 нм), фотостабильны и легко конъюгируются с антителами, поэтому они широко используются.

Стоит отметить, что красители Alexa Fluor более фотостабильны, чем FITC, поэтому, если вы хотите создавать изображения, они — ваш выбор.

2. Фикобилипротеин

Фикобилипротеины представляют собой крупные белковые молекулы, экстрагированные из таких водорослей, как цианобактерии и динофлагелляты. Например, фикоэритрин (ПЭ) имеет молекулярную массу 240 000 Да. Эти белки имеют большие стоксовы сдвиги (75–200 нм) и стабильные спектры излучения. Поскольку фикобилипротеины имеют большие размеры, они обычно имеют соотношение белка к флуорохрому 1: 1 во время конъюгации, что делает их полезными для количественной проточной цитометрии.

Однако фикобилипротеины чувствительны к фотообесцвечиванию, поэтому длительное или многократное воздействие источников возбуждающего света не рекомендуется.

В семействе фикобилипротеинов, помимо фикоэритрина (PE), имеются аллофикоцианин (APC) и белок хлорофилла Momordica (PerCP).

3. Квантовые точки

Квантовые точки (Qdots) представляют собой полупроводниковые нанокристаллы, спектры флуоресцентного излучения которых тесно связаны с размером нанокристаллов. Они лучше всего возбуждаются ультрафиолетовым или фиолетовым светом, но также легко возбуждаются другими лазерами в небольших количествах, поэтому при использовании Qdots в многопараметрических экспериментах это крошечное возбуждение лазеров с другими длинами волн усложняет компенсацию флуоресценции.

Таким образом, хотя красители для квантовых точек обладают высокой яркостью, эти реагенты в основном заменяются полимерными красителями в многопараметрических схемах из-за трудноразрешимости этих проблем компенсации и сложности связывания Qdots с антителами.

4. Полимерные красители

Макромолекулярные (полимерные) красители состоят из полимерных цепей, которые собирают световые сигналы и могут «настраивать» поглощение и излучение определенных длин волн света в зависимости от длины полимерной цепи и присоединенных молекулярных субъединиц. Эти красители очень стабильны и имеют квантовую эффективность, аналогичную фикобилипротеинам, но со значительно улучшенной фотостабильностью.

Поскольку полимерные красители могут поглощать только определенные длины волн света, можно избежать проблемы перекрестного возбуждения Qточек.

Типичными представителями полимерных красителей являются бриллиантовый фиолетовый (BV), бриллиантовый ультрафиолет (BUV) и бриллиантовый синий (BB).

5. Тандемные красители

Тандемные красители химически соединяют фикобилипротеины (PE, APC, PerCP) или макромолекулярные красители (BV421, BUV395) с органическими низкомолекулярными флуоресцентными красителями (Cy3, Cy5, Cy7) и используют перенос энергии флуоресценции (FRET) для формирования единого лазера. Возбуждаются больше длин волн излучаемого света.

Например, максимум возбуждения Texas Red составляет 589 нм, а излучение PE составляет 585 нм, поэтому при соединении PE с Texas Red свет излучения PE возбуждает Texas Red через FRET, что делает PE-TxRed доступным при лазерном возбуждении 488 нм или 532 нм.

Тот же метод можно использовать и для полимерных антител в сочетании с органическими низкомолекулярными красителями.

Тандемные красители очень яркие и имеют большие значения стоксова сдвига (150–300 нм), что полезно при обнаружении антигенов низкой плотности. Однако тандемные красители менее стабильны, чем донорские флуорохромы, а эффективность передачи энергии варьируется от партии к партии, что усложняет компенсацию.

6. Ионы тяжелых металлов

Ионы тяжелых металлов, строго говоря, не являются флуоресцеином, но мы также упоминаем их здесь.

Антитела, используемые в массовой цитометрии, не конъюгированы с флуоресцеином, а конъюгированы с ионами тяжелых металлов одного изотопа ряда лантаноидов. В настоящее время коммерчески доступны 35 изотопов лантаноидов для конъюгации антител. Эти зонды не флуоресцентны и подходят только для масс-цитометрии.

7. Флуоресцентный белок

Флуоресцентные белки часто используются в качестве репортерных систем для экспрессии генов. Наиболее часто используется зеленый флуоресцентный белок (GFP) Aequorea victoria. Отсюда получаются CFP и YFP.

Красный флуоресцентный белок (DsRed) получен из гриба актинии Discosoma, а мономерные флуоресцентные белки следующего поколения (mCherry, mBanana) получены из DsRed и имеют более широкие спектры возбуждения и излучения.

С развитием технологии клонирования генов появились сотни флуоресцентных белков, спектры возбуждения и излучения которых варьируются от ультрафиолетового до ближнего инфракрасного диапазона.

8. Красители нуклеиновых кислот.

Красители нуклеиновых кислот связывают ДНК, РНК или и то, и другое. Их можно использовать для количественного определения ДНК для анализа клеточного цикла (например, PI, 7-AAD, DyeCycle Violet, DAPI), сортировки хромосом (например, Hoescht 33342, хромомицин A3), сортировки стволовых клеток с использованием бокового популяционного анализа (например, Hoescht 33342). Дифференцируются живые и мертвые клетки и сортируются бактерии.

Уровень пролиферации можно определить путем объединения красителей нуклеиновых кислот с другой меткой, такой как антибромдезоксиуридин, конъюгированный с флуоресцентным красителем (BrdU).

9. Красители для клеточной пролиферации.

Пролиферацию клеток измеряют путем инкубации клеток с BrdU (бромдезоксиуридином), который участвует в синтезе клеточной ДНК, а затем окрашивания антителами и красителями ДНК, направленными против BrdU. Однако этот метод не подходит для долгосрочных исследований распространения.

Сукцинимидиловый эфир карбоксифлуоресцеина (CFSE) можно использовать для отслеживания множественных делений пролиферирующих клеток. Теперь также доступны красные и фиолетовые варианты красителей CFSE. В соответствующих концентрациях эти красители не влияют на рост или морфологию клеток, что делает их пригодными для долгосрочных исследований пролиферации.

10. Краситель гибели клеток

Жизнеспособность клеток можно определить с помощью эксклюзионных красителей (например, йодида пропидия, DAPI) или путем связывания красителей с внутриклеточными аминами.

Эксклюзионные красители не могут быть фиксированными и подходят только для неинфекционных клеток, требующих немедленного анализа.

Аминовые красители, включая Live/Dead (ThermoFisher), Zombie (Biolegend) или Fixable Viablity (BD Biosciences), подходят для фиксированных клеток и, следовательно, для клеток с инфекционными клетками, клеток, окрашенных внутриклеточными антигенами, клеток, фиксированных параформальдегидом.

11. Краситель-индикатор кальция.

Красители-индикаторы кальция меняют цвет при связывании с кальцием и могут использоваться для обозначения клеточной активации и передачи сигналов.

Наиболее часто используемым красителем по-прежнему остается индо-1, двухфазный УФ-зонд кальция. Существуют также сине-зеленые кальциевые зонды для флуо-3.