Akış floresan boya türleri nelerdir?

Akış sitometrisinin geliştirilmesi için en önemli itici güç antikorlardır ve bunu cihazın tespit yetenekleriyle eşleşen floresan boyalar takip eder. Floresan boyalar hala cihaz algılama kanallarının sayısına ayak uyduramıyor.

Mevcut akışlı floresan boyalar aşağıdaki 11 kategoriye ayrılabilir:

1. Küçük organik moleküller

Küçük organik moleküller söz konusu olduğunda çoğu insanın kafası karışmış olmalı, ancak birkaç örnek verirsem kesinlikle aklıma gelecektir.

FITC (389 Da), Alexa Fluor 488 (FITC analogu, 643 Da), Texas Red (TxRed, 625 Da), Alexa Fluor 647 (1155 Da), Pacific Blue (242 Da) ve Cy5 (242 Da) 762 Da). Temel olarak kullanılıyor mu?

Bu küçük organik moleküller tutarlı bir emisyon spektrumuna ve küçük Stokes kaymasına (uyarma ve emisyon dalga boyları arasındaki fark, yaklaşık 50-100 nm) sahiptirler, fotostabildirler ve antikorlara kolayca konjuge olurlar, bu nedenle yaygın olarak kullanılırlar.

Alexa Fluor boyalarının FITC'den daha fotostabil olduğunu belirtmekte fayda var, bu yüzden eğer görselleştirmek istiyorsanız seçim onlar.

2. Fikobiliprotein

Fikobiliproteinler, siyanobakteriler ve dinoflagellatlar gibi alglerden ekstrakte edilen büyük protein molekülleridir. Örneğin fikoeritrin (PE), 240.000 Da'lık bir moleküler ağırlığa sahiptir. Bu proteinler büyük Stokes kaymalarına (75-200 nm) ve kararlı emisyon spektrumlarına sahiptir. Fikobiliproteinler büyük olduğundan konjugasyon sırasında tipik olarak 1:1 protein/florokrom oranına sahiptirler, bu da onları kantitatif akış sitometrisi için faydalı kılar.

Bununla birlikte, fikobiliproteinler ışıkla ağartmaya karşı hassastır, bu nedenle uyarıcı ışık kaynaklarına uzun süreli veya tekrarlı maruz kalma önerilmez.

Fikobiliprotein ailesinde fikoeritrine (PE) ek olarak allofikosiyanin (APC) ve Momordica klorofil proteini (PerCP) de bulunur.

3. Kuantum noktaları

Kuantum noktaları (Qdots), nanokristallerin boyutuyla yakından ilişkili olan floresans emisyon spektrumlarına sahip yarı iletken nanokristallerdir. En iyi ultraviyole veya mor ışıkla uyarılırlar, ancak aynı zamanda küçük miktarlarda diğer lazerler tarafından da kolayca uyarılırlar; bu nedenle, çok parametreli deneylerde Qdots kullanıldığında, lazerlerin diğer dalga boylarındaki bu küçük uyarım, floresans telafisini karmaşık hale getirir.

Bu nedenle, kuantum nokta boyaları yüksek parlaklığa sahip olmasına rağmen, bu dengeleme sorunlarının inatçılığı ve Qdot'ları antikorlara bağlamanın zorluğu nedeniyle, çok parametreli şemalarda bu reaktiflerin yerini çoğunlukla polimer boyalar alır.

4. Polimer boyalar

Makromoleküler (polimer) boyalar, ışık sinyallerini toplayan ve polimer zincirinin uzunluğuna ve bağlı moleküler alt birimlere bağlı olarak ışığın belirli dalga boylarının emilimini ve emisyonunu 'ayarlayabilen' polimer zincirlerinden oluşur. Bu boyalar çok stabildir ve büyük ölçüde geliştirilmiş fotostabilite ile fikobiliproteinlere benzer kuantum verimliliklerine sahiptir.

Polimer boyalar ışığın yalnızca belirli dalga boylarını emecek şekilde yapılabildiğinden, Qdots'un dalga boyları arası uyarılması sorunu ortadan kalkar.

Polimer boyaların tipik temsilcileri Parlak Mor (BV), Parlak Ultraviyole (BUV) ve Parlak Mavidir (BB).

5. Tandem boyalar

Tandem boyalar, fikobiliproteinleri (PE, APC, PerCP) veya makromoleküler boyaları (BV421, BUV395) organik küçük moleküllü floresan boyalarla (Cy3, Cy5, Cy7) kimyasal olarak birleştirir ve tek bir lazer oluşturmak için floresans enerji aktarımını (FRET) kullanır. Yayılan ışığın daha fazla dalga boyu heyecanlanır.

Örneğin, Texas Red'in uyarılma maksimumu 589 nm iken PE'nin emisyonu 585 nm'dir; dolayısıyla PE'nin Texas Red ile birleştirilmesiyle, PE'nin emisyon ışığı FRET aracılığıyla Texas Red'i uyarır, böylece PE-TxRed'i 488 nm veya 532 nm Lazer uyarımında kullanılabilir hale getirir.

Aynı yöntem, organik küçük moleküllü boyalarla birlikte polimer antikorlar için de kullanılabilir.

Tandem boyalar çok parlaktır ve düşük yoğunluklu antijenlerin saptanmasında yararlı olan büyük Stokes kayma değerlerine (150-300 nm) sahiptir. Bununla birlikte, tandem boyalar donör florokromlarından daha az stabildir ve enerji aktarım verimliliği partiden partiye farklılık göstererek kompanzasyonu karmaşık hale getirir.

6. Ağır metal iyonları

Ağır metal iyonları tam anlamıyla floresan değildir ancak burada onlardan da bahsediyoruz.

Kütle sitometrisinde kullanılan antikorlar floresein ile konjuge değildir ancak lantanit serisindeki tek bir izotopun ağır metal iyonlarına konjuge edilir. Şu anda antikor konjugasyonu için ticari olarak temin edilebilen 35 lantanit izotopu bulunmaktadır. Bu problar floresan değildir ve yalnızca kütle sitometrisi için uygundur.

7. Floresan proteini

Floresan proteinler sıklıkla gen ekspresyonu için raportör sistemler olarak kullanılır. En yaygın olarak kullanılanı Aequorea victoria'dan elde edilen yeşil floresan proteindir (GFP). Bundan CFP ve YFP türetilir.

Kırmızı floresan proteini (DsRed) mantar deniz anemonu Discosoma'dan türetilir ve yeni nesil monomerik floresan proteinleri (mCherry, mBanana) DsRed'den türetilir ve daha geniş uyarılma ve emisyon spektrumlarına sahiptir.

Gen klonlama teknolojisinin gelişmesiyle birlikte, uyarılma ve emisyon spektrumları ultraviyoleden yakın kızılötesine kadar değişen yüzlerce floresan protein ortaya çıktı.

8. Nükleik asit boyaları

Nükleik asit boyaları DNA'ya, RNA'ya veya her ikisine birden bağlanır. Hücre döngüsü analizi (örn. PI, 7-AAD, DyeCycle Violet, DAPI) için DNA miktarını belirlemek, kromozomları sıralamak (örn. Hoescht 33342, Chromomycin A3), yan popülasyon analizini kullanarak kök hücreleri sıralamak (örn. Hoescht 33342), Canlı ve ölü hücreler ayırt etmek ve bakterileri sıralamak için kullanılabilirler.

Çoğalma düzeyi, nükleik asit boyalarının, floresan boyayla konjuge edilmiş anti-bromodeoksiüridin (BrdU) gibi başka bir etiketle birleştirilmesiyle belirlenebilir.

9. Hücre çoğalmasını sağlayan boyalar

Hücre proliferasyonu, hücrelerin, hücresel DNA sentezine dahil edilen BrdU (bromodeoksiüridin) ile inkübe edilmesi ve ardından BrdU'ya karşı yönlendirilen antikorlar ve DNA boyaları ile boyanması yoluyla ölçülür. Ancak bu yöntem uzun vadeli çoğalma çalışmaları için uygun değildir.

Karboksifloresein süksinimidil ester (CFSE), çoğalan hücrelerin birden fazla bölünmesini izlemek için kullanılabilir. CFSE boyalarının kırmızı ve mor çeşitleri de artık mevcuttur. Uygun konsantrasyonlarda bu boyalar hücre büyümesini veya morfolojisini etkilemez, bu da onları uzun vadeli çoğalma çalışmaları için uygun kılar.

10. Hücre ölümü boyası

Hücre canlılığı, dışlama boyaları (örneğin, propidyum iyodür, DAPI) veya boyaların hücre içi aminlere bağlanmasıyla belirlenebilir.

Dışlama boyaları sabitlenemez ve yalnızca bulaşıcı olmayan ve acil analiz gerektiren hücreler için uygundur.

Canlı/Ölü (ThermoFisher), Zombi (Biolegend) veya Sabitlenebilir Canlılık (BD Biosciences) dahil olmak üzere amin boyalar, sabit hücreler ve dolayısıyla bulaşıcı hücrelere sahip olanlar, hücre içi antijenlerle boyanmış hücreler, paraformaldehit ile sabitlenmiş hücreler için uygundur.

11. Kalsiyum gösterge boyası

Kalsiyum gösterge boyaları, kalsiyuma bağlandıklarında renk değişimine uğrar ve hücresel aktivasyonu ve sinyali belirtmek için kullanılabilir.

En yaygın kullanılan boya hala UV bifazik kalsiyum probu olan indo-1'dir. Fluo-3 için Mavi-yeşil kalsiyum probları da vardır.