Apa saja jenis pewarna fluoresen aliran?

Untuk pengembangan flow cytometry, kekuatan pendorong terpenting adalah antibodi, diikuti oleh pewarna fluoresen yang sesuai dengan kemampuan deteksi instrumen. Pewarna fluoresen masih belum bisa mengimbangi jumlah saluran deteksi instrumen.

Pewarna fluoresen aliran yang ada dapat dibagi menjadi 11 kategori berikut:

1. Molekul organik kecil

Ketika berbicara tentang molekul organik kecil, kebanyakan orang pasti bingung, tetapi jika saya memberikan beberapa contoh, saya pasti akan sadar.

FITC (389 Da), Alexa Fluor 488 (analog FITC, 643 Da), Texas Red (TxRed, 625 Da), Alexa Fluor 647 (1155 Da), Pacific Blue (242 Da), dan Cy5 (242 Da) 762 Da). Apakah pada dasarnya digunakan?

Molekul organik kecil ini memiliki spektrum emisi yang konsisten dan pergeseran Stokes yang kecil (perbedaan antara panjang gelombang eksitasi dan emisi, sekitar 50-100 nm), bersifat fotostabil, dan mudah terkonjugasi menjadi antibodi, sehingga banyak digunakan.

Perlu disebutkan bahwa pewarna Alexa Fluor lebih mudah difoto daripada FITC, jadi jika Anda ingin membuat gambar, itulah pilihannya.

2. Fikobiliprotein

Phycobiliprotein adalah molekul protein besar yang diekstraksi dari alga seperti cyanobacteria dan dinoflagellata. Misalnya, fikoeritrin (PE) memiliki berat molekul 240.000 Da. Protein ini memiliki pergeseran Stokes yang besar (75-200 nm) dan spektrum emisi yang stabil. Karena phycobiliprotein berukuran besar, mereka biasanya memiliki rasio protein terhadap fluorokrom 1:1 selama konjugasi, sehingga berguna untuk sitometri aliran kuantitatif.

Namun, phycobiliprotein rentan terhadap photobleaching, sehingga paparan sumber cahaya eksitasi dalam waktu lama atau berulang tidak dianjurkan.

Pada keluarga phycobiliprotein, selain phycoerythrin (PE), terdapat allophycocyanin (APC) dan Momordica chlorophyll protein (PerCP).

3. Titik kuantum

Titik kuantum (Qdots) adalah nanokristal semikonduktor dengan spektrum emisi fluoresensi yang berkaitan erat dengan ukuran nanokristal. Mereka paling tereksitasi oleh sinar ultraviolet atau ungu, tetapi juga mudah tereksitasi oleh laser lain dalam jumlah kecil, jadi saat menggunakan Qdots dalam eksperimen multiparameter, eksitasi kecil dari laser dengan panjang gelombang lain ini mempersulit kompensasi fluoresensi.

Dengan demikian, meskipun pewarna titik kuantum memiliki kecerahan tinggi, reagen ini sebagian besar digantikan oleh pewarna polimer dalam skema multiparameter karena sulitnya mengatasi masalah kompensasi ini dan sulitnya mengikat Qdots ke antibodi.

4. Pewarna polimer

Pewarna makromolekul (polimer) terdiri dari rantai polimer yang mengumpulkan sinyal cahaya dan dapat “menyesuaikan” penyerapan dan emisi panjang gelombang cahaya tertentu, bergantung pada panjang rantai polimer dan subunit molekul yang terikat. Pewarna ini sangat stabil dan memiliki efisiensi kuantum mirip dengan phycobiliprotein dengan fotostabilitas yang jauh lebih baik.

Karena pewarna polimer dapat dibuat untuk hanya menyerap panjang gelombang cahaya tertentu, masalah eksitasi Qdots sepanjang gelombang silang dapat dihindari.

Perwakilan khas pewarna polimer adalah Brilliant Violet (BV), Brilliant Ultraviolet (BUV) dan Brilliant Blue (BB).

5. Pewarna tandem

Pewarna tandem secara kimia menggabungkan phycobiliprotein (PE, APC, PerCP) atau pewarna makromolekul (BV421, BUV395) dengan pewarna fluoresen molekul kecil organik (Cy3, Cy5, Cy7), dan menggunakan transfer energi fluoresensi (FRET) untuk membentuk laser tunggal. Lebih banyak panjang gelombang cahaya yang dipancarkan tereksitasi.

Misalnya, eksitasi maksimum Texas Red adalah 589 nm, sedangkan emisi PE adalah 585 nm, jadi dengan menggabungkan PE dengan Texas Red, cahaya emisi PE merangsang Texas Red melalui FRET, sehingga membuat PE-TxRed tersedia pada 488 nm atau eksitasi laser 532 nm.

Metode yang sama juga dapat digunakan untuk antibodi polimer bersama-sama dengan pewarna organik molekul kecil.

Pewarna tandem sangat cerah dan memiliki nilai pergeseran Stokes yang besar (150-300 nm), yang berguna saat mendeteksi antigen dengan kepadatan rendah. Namun, pewarna tandem kurang stabil dibandingkan fluorokrom donor, dan efisiensi transfer energi bervariasi dari satu batch ke batch lainnya, sehingga mempersulit kompensasi.

6. Ion logam berat

Ion logam berat sebenarnya bukan fluorescein, tetapi kami juga menyebutkannya di sini.

Antibodi yang digunakan dalam sitometri massal tidak terkonjugasi dengan fluorescein, tetapi terkonjugasi menjadi ion logam berat dari satu isotop dalam deret lantanida. Saat ini terdapat 35 isotop lantanida yang tersedia secara komersial untuk konjugasi antibodi. Probe ini tidak berpendar dan hanya cocok untuk sitometri massal.

7. Protein neon

Protein fluoresen sering digunakan sebagai sistem reporter untuk ekspresi gen. Yang paling umum digunakan adalah protein fluoresen hijau (GFP) dari Aequorea victoria. Dari sini, CFP dan YFP diturunkan.

Protein fluoresen merah (DsRed) berasal dari anemon laut jamur Discosoma, dan protein fluoresen monomerik generasi berikutnya (mCherry, mBanana) berasal dari DsRed dan memiliki spektrum eksitasi dan emisi yang lebih luas.

Dengan kematangan teknologi kloning gen, terdapat ratusan protein fluoresen, yang spektrum eksitasi dan emisinya berkisar dari ultraviolet hingga inframerah-dekat.

8. Pewarna asam nukleat

Pewarna asam nukleat mengikat DNA, RNA, atau keduanya. Mereka dapat digunakan untuk mengukur DNA untuk analisis siklus sel (misalnya PI, 7-AAD, DyeCycle Violet, DAPI), mengurutkan kromosom (misalnya Hoescht 33342, Chromomycin A3), mengurutkan sel induk menggunakan analisis populasi sampingan (misalnya Hoescht 33342), Sel hidup dan mati dibedakan dan bakteri diurutkan.

Tingkat proliferasi dapat ditentukan dengan menggabungkan pewarna asam nukleat dengan label lain, seperti anti-bromodeoxyuridine (BrdU) terkonjugasi pewarna fluoresen.

9. Pewarna proliferasi sel

Proliferasi sel diukur dengan menginkubasi sel dengan BrdU (bromodeoxyuridine), yang dimasukkan ke dalam sintesis DNA seluler, dan kemudian diwarnai dengan antibodi dan pewarna DNA yang ditujukan untuk melawan BrdU. Namun, metode ini tidak cocok untuk studi proliferasi jangka panjang.

Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) dapat digunakan untuk melacak beberapa pembelahan sel yang berkembang biak. Varian pewarna CFSE merah dan ungu juga kini tersedia. Pada konsentrasi yang sesuai, pewarna ini tidak mempengaruhi pertumbuhan atau morfologi sel, sehingga cocok untuk studi proliferasi jangka panjang.

10. Pewarna kematian sel

Kelangsungan hidup sel dapat ditentukan dengan pengecualian pewarna (misalnya propidium iodida, DAPI) atau dengan pengikatan pewarna pada amina intraseluler.

Pewarna eksklusi tidak dapat diperbaiki dan hanya cocok untuk sel yang tidak menular dan memerlukan analisis segera.

Pewarna amina termasuk Hidup/Mati (ThermoFisher), Zombie (Biolegend) atau Fixable Viablity (BD Biosciences) cocok untuk sel yang sudah difiksasi dan oleh karena itu cocok untuk sel yang memiliki sel infeksius, sel yang diwarnai dengan antigen intraseluler, sel yang difiksasi dengan paraformaldehyde.

11. Pewarna indikator kalsium

Pewarna indikator kalsium mengalami perubahan warna saat berikatan dengan kalsium dan dapat digunakan untuk menunjukkan aktivasi dan sinyal seluler.

Pewarna yang paling umum digunakan masih indo-1, probe kalsium bifasik UV. Ada juga probe kalsium biru-hijau untuk fluo-3.