Quels sont les types de colorants fluorescents à flux ?

Pour le développement de la cytométrie en flux, la force motrice la plus importante est constituée par les anticorps, suivis par les colorants fluorescents qui correspondent aux capacités de détection de l'instrument. Les colorants fluorescents ne suivent toujours pas le nombre de canaux de détection des instruments.

Les colorants fluorescents à flux continu existants peuvent être divisés dans les 11 catégories suivantes :

1. Petites molécules organiques

Lorsqu’il s’agit de petites molécules organiques, la plupart des gens doivent être confus, mais si je donne quelques exemples, cela me viendra certainement à l’esprit.

FITC (389 Da), Alexa Fluor 488 (analogue FITC, 643 Da), Texas Red (TxRed, 625 Da), Alexa Fluor 647 (1155 Da), Pacific Blue (242 Da) et Cy5 (242 Da) 762 Da). Est-il fondamentalement utilisé ?

Ces petites molécules organiques ont un spectre d'émission cohérent et un petit décalage de Stokes (différence entre les longueurs d'onde d'excitation et d'émission, environ 50 à 100 nm), sont photostables et se conjuguent facilement aux anticorps, elles sont donc largement utilisées.

Il convient de mentionner que les colorants Alexa Fluor sont plus photostables que FITC, donc si vous souhaitez créer une image, ils sont le choix.

2. Phycobiliprotéine

Les phycobiliprotéines sont de grosses molécules protéiques extraites d'algues telles que les cyanobactéries et les dinoflagellés. Par exemple, la phycoérythrine (PE) a un poids moléculaire de 240 000 Da. Ces protéines ont de grands déplacements de Stokes (75-200 nm) et des spectres d'émission stables. Étant donné que les phycobiliprotéines sont volumineuses, elles ont généralement un rapport protéine/fluorochrome de 1:1 pendant la conjugaison, ce qui les rend utiles pour la cytométrie en flux quantitative.

Cependant, les phycobiliprotéines sont sensibles au photoblanchiment, c'est pourquoi une exposition prolongée ou répétée à des sources de lumière d'excitation n'est pas recommandée.

Dans la famille des phycobiliprotéines, outre la phycoérythrine (PE), il existe l'allophycocyanine (APC) et la protéine chlorophylle Momordica (PerCP).

3. Points quantiques

Les points quantiques (Qdots) sont des nanocristaux semi-conducteurs dont les spectres d'émission de fluorescence sont étroitement liés à la taille des nanocristaux. Ils sont mieux excités par la lumière ultraviolette ou violette, mais sont également facilement excités par d'autres lasers en petites quantités. Ainsi, lors de l'utilisation de Qdots dans des expériences multiparamétriques, cette minuscule excitation d'autres longueurs d'onde de lasers complique la compensation de fluorescence.

En tant que tel, bien que les colorants à points quantiques aient une luminosité élevée, ces réactifs sont pour la plupart remplacés par des colorants polymères dans les schémas multiparamétriques en raison de la difficulté de résoudre ces problèmes de compensation et de la difficulté de lier les Qdots aux anticorps.

4. Colorants polymères

Les colorants macromoléculaires (polymères) sont constitués de chaînes polymères qui collectent des signaux lumineux et peuvent « ajuster » l'absorption et l'émission de longueurs d'onde spécifiques de la lumière, en fonction de la longueur de la chaîne polymère et des sous-unités moléculaires qui y sont attachées. Ces colorants sont très stables et ont des efficacités quantiques similaires à celles des phycobiliprotéines avec une photostabilité grandement améliorée.

Étant donné que les colorants polymères peuvent être amenés à absorber uniquement des longueurs d'onde spécifiques de la lumière, le problème de l'excitation des Qdots à longueur d'onde croisée est évité.

Les représentants typiques des colorants polymères sont le Brilliant Violet (BV), le Brilliant Ultraviolet (BUV) et le Brilliant Blue (BB).

5. Teintures tandem

Les colorants tandem couplent chimiquement des phycobiliprotéines (PE, APC, PerCP) ou des colorants macromoléculaires (BV421, BUV395) avec des colorants fluorescents organiques à petites molécules (Cy3, Cy5, Cy7) et utilisent le transfert d'énergie de fluorescence (FRET) pour former un laser unique. Plus de longueurs d'onde de lumière émise sont excitées.

Par exemple, l'excitation maximale du Texas Red est de 589 nm, tandis que l'émission du PE est de 585 nm, donc en couplant le PE avec le Texas Red, la lumière d'émission du PE excite le Texas Red via FRET, rendant ainsi PE-TxRed disponible à 488 nm ou 532 nm d'excitation laser.

La même méthode peut également être utilisée pour les anticorps polymères en tandem avec des colorants organiques à petites molécules.

Les colorants tandem sont très brillants et ont de grandes valeurs de décalage de Stokes (150 à 300 nm), qui sont utiles lors de la détection d'antigènes de faible densité. Cependant, les colorants tandem sont moins stables que les fluorochromes donneurs et l’efficacité du transfert d’énergie varie d’un lot à l’autre, ce qui complique la compensation.

6. Ions de métaux lourds

Les ions de métaux lourds ne sont pas à proprement parler la fluorescéine, mais nous les mentionnons également ici.

Les anticorps utilisés en cytométrie de masse ne sont pas conjugués à la fluorescéine, mais aux ions de métaux lourds d'un seul isotope de la série des lanthanides. Il existe actuellement 35 isotopes des lanthanides disponibles dans le commerce pour la conjugaison d'anticorps. Ces sondes sont non fluorescentes et conviennent uniquement à la cytométrie de masse.

7. Protéine fluorescente

Les protéines fluorescentes sont fréquemment utilisées comme systèmes rapporteurs pour l’expression des gènes. La plus couramment utilisée est la protéine fluorescente verte (GFP) d’Aequorea victoria. De là, CFP et YFP sont dérivés.

La protéine fluorescente rouge (DsRed) est dérivée de l'anémone de mer champignon Discosoma, et les protéines fluorescentes monomères de nouvelle génération (mCherry, mBanana) sont dérivées de DsRed et ont des spectres d'excitation et d'émission plus larges.

Avec la maturité de la technologie de clonage de gènes, il existe des centaines de protéines fluorescentes, dont les spectres d’excitation et d’émission vont de l’ultraviolet au proche infrarouge.

8. Colorants d'acide nucléique

Les colorants d'acide nucléique se lient à l'ADN, à l'ARN ou aux deux. Ils peuvent être utilisés pour quantifier l'ADN pour l'analyse du cycle cellulaire (par exemple PI, 7-AAD, DyeCycle Violet, DAPI), trier les chromosomes (par exemple Hoescht 33342, Chromomycine A3), trier les cellules souches à l'aide d'une analyse de population secondaire (par exemple Hoescht 33342), les cellules vivantes et mortes sont différenciées et les bactéries sont triées.

Le niveau de prolifération peut être déterminé en combinant des colorants d'acide nucléique avec un autre marqueur, tel qu'un anti-bromodésoxyuridine (BrdU) conjugué à un colorant fluorescent.

9. Colorants pour la prolifération cellulaire

La prolifération cellulaire est mesurée en incubant les cellules avec de la BrdU (bromodésoxyuridine), qui est incorporée dans la synthèse de l'ADN cellulaire, puis colorée avec des anticorps et des colorants d'ADN dirigés contre la BrdU. Cependant, cette méthode n’est pas adaptée aux études de prolifération à long terme.

L'ester succinimidylique de carboxyfluorescéine (CFSE) peut être utilisé pour suivre plusieurs divisions de cellules en prolifération. Des variantes rouges et violettes des colorants CFSE sont également désormais disponibles. À des concentrations appropriées, ces colorants n’affectent pas la croissance ou la morphologie cellulaire, ce qui les rend adaptés aux études de prolifération à long terme.

10. Colorant de mort cellulaire

La viabilité cellulaire peut être déterminée par des colorants d'exclusion (par exemple, l'iodure de propidium, DAPI) ou par la liaison de colorants à des amines intracellulaires.

Les colorants d'exclusion ne peuvent pas être fixés et ne conviennent qu'aux cellules qui ne sont pas infectieuses et nécessitent une analyse immédiate.

Les colorants aminés dont Live/Dead (ThermoFisher), Zombie (Biolegend) ou Fixable Viablity (BD Biosciences) conviennent aux cellules fixées et donc à celles comportant des cellules infectieuses, aux cellules colorées avec des antigènes intracellulaires, aux cellules fixées au paraformaldéhyde.

11. Colorant indicateur de calcium

Les colorants indicateurs de calcium subissent un changement de couleur lors de leur liaison au calcium et peuvent être utilisés pour indiquer l'activation et la signalisation cellulaires.

Le colorant le plus couramment utilisé reste l’Indo-1, la sonde UV biphasique du calcium. Il existe également des sondes de calcium bleu-vert pour le fluo-3.