Quais são os tipos de corantes fluorescentes de fluxo?

Para o desenvolvimento da citometria de fluxo, a força motriz mais importante são os anticorpos, seguidos pelos corantes fluorescentes que correspondem às capacidades de detecção do instrumento. Os corantes fluorescentes ainda não acompanham o número de canais de detecção de instrumentos.

Os corantes fluorescentes de fluxo existentes podem ser divididos nas seguintes 11 categorias:

1. Pequenas moléculas orgânicas

Quando se trata de pequenas moléculas orgânicas, a maioria das pessoas deve estar confusa, mas se eu der alguns exemplos, com certeza vou perceber.

FITC (389 Da), Alexa Fluor 488 (análogo FITC, 643 Da), Texas Red (TxRed, 625 Da), Alexa Fluor 647 (1155 Da), Pacific Blue (242 Da) e Cy5 (242 Da) 762 Da). É basicamente usado?

Essas pequenas moléculas orgânicas têm espectro de emissão consistente e pequeno deslocamento de Stokes (diferença entre comprimentos de onda de excitação e emissão, aproximadamente 50-100 nm), são fotoestáveis ​​e são facilmente conjugadas a anticorpos, por isso são amplamente utilizadas.

Vale ressaltar que os corantes Alexa Fluor são mais fotoestáveis ​​que o FITC, então se você quiser fazer uma imagem, eles são a escolha.

2. Ficobiliproteína

As ficobiliproteínas são grandes moléculas de proteína extraídas de algas, como cianobactérias e dinoflagelados. Por exemplo, a ficoeritrina (PE) tem um peso molecular de 240.000 Da. Estas proteínas têm grandes desvios de Stokes (75-200 nm) e espectros de emissão estáveis. Como as ficobiliproteínas são grandes, elas normalmente apresentam uma proporção de proteína para fluorocromo de 1:1 durante a conjugação, tornando-as úteis para citometria de fluxo quantitativa.

No entanto, as ficobiliproteínas são suscetíveis à fotodegradação, portanto a exposição prolongada ou repetida a fontes de luz de excitação não é recomendada.

Na família das ficobiliproteínas, além da ficoeritrina (PE), estão a aloficocianina (APC) e a proteína clorofila de Momordica (PerCP).

3. Pontos quânticos

Os pontos quânticos (Qdots) são nanocristais semicondutores com espectros de emissão de fluorescência que estão intimamente relacionados ao tamanho dos nanocristais. Eles são melhor excitados por luz ultravioleta ou violeta, mas também são facilmente excitados por outros lasers em pequenas quantidades, portanto, ao usar Qdots em experimentos multiparâmetros, essa pequena excitação de outros comprimentos de onda de lasers complica a compensação de fluorescência.

Como tal, embora os corantes de pontos quânticos tenham alto brilho, estes reagentes são na sua maioria substituídos por corantes poliméricos em esquemas multiparâmetros devido à intratabilidade destas questões de compensação e à dificuldade de ligação de Qdots a anticorpos.

4. Corantes de polímero

Os corantes macromoleculares (polímeros) consistem em cadeias poliméricas que coletam sinais de luz e podem “sintonizar” a absorção e emissão de comprimentos de onda específicos de luz, dependendo do comprimento da cadeia polimérica e das subunidades moleculares que estão ligadas. Esses corantes são muito estáveis ​​e possuem eficiências quânticas semelhantes às ficobiliproteínas, com fotoestabilidade bastante melhorada.

Uma vez que os corantes poliméricos podem ser feitos para absorver apenas comprimentos de onda específicos de luz, o problema da excitação de comprimentos de onda cruzados de Qdots é evitado.

Representantes típicos de corantes poliméricos são Violeta Brilhante (BV), Ultravioleta Brilhante (BUV) e Azul Brilhante (BB).

5. Corantes tandem

Os corantes tandem acoplam quimicamente ficobiliproteínas (PE, APC, PerCP) ou corantes macromoleculares (BV421, BUV395) com corantes fluorescentes orgânicos de pequenas moléculas (Cy3, Cy5, Cy7) e usam transferência de energia de fluorescência (FRET) para formar um único laser. Mais comprimentos de onda de luz emitida são excitados.

Por exemplo, o máximo de excitação do Texas Red é 589 nm, enquanto a emissão do PE é 585 nm, portanto, ao acoplar o PE com o Texas Red, a luz de emissão do PE excita o Texas Red através do FRET, tornando assim o PE-TxRed disponível em 488 nm ou excitação a laser de 532 nm.

O mesmo método também pode ser usado para anticorpos poliméricos em conjunto com corantes orgânicos de pequenas moléculas.

Os corantes tandem são muito brilhantes e possuem grandes valores de deslocamento de Stokes (150-300 nm), que são úteis na detecção de antígenos de baixa densidade. No entanto, os corantes tandem são menos estáveis ​​que os fluorocromos doadores, e a eficiência da transferência de energia varia de lote para lote, complicando a compensação.

6. Íons de metais pesados

Os íons de metais pesados ​​não são propriamente fluoresceína, mas também os mencionamos aqui.

Os anticorpos utilizados na citometria de massa não são conjugados com fluoresceína, mas são conjugados com íons de metais pesados ​​de um único isótopo da série dos lantanídeos. Existem atualmente 35 isótopos de lantanídeos disponíveis comercialmente para conjugação de anticorpos. Estas sondas não são fluorescentes e são adequadas apenas para citometria de massa.

7. Proteína fluorescente

Proteínas fluorescentes são frequentemente utilizadas como sistemas repórteres para expressão genética. A mais comumente usada é a proteína fluorescente verde (GFP) de Aequorea victoria. Disto derivam o CFP e o YFP.

A proteína fluorescente vermelha (DsRed) é derivada do cogumelo anêmona do mar Discosoma, e as proteínas fluorescentes monoméricas de próxima geração (mCherry, mBanana) são derivadas de DsRed e possuem espectros de excitação e emissão mais amplos.

Com a maturidade da tecnologia de clonagem genética, existem centenas de proteínas fluorescentes, cujos espectros de excitação e emissão variam do ultravioleta ao infravermelho próximo.

8. Corantes de ácido nucleico

Os corantes de ácido nucleico ligam-se ao DNA, RNA ou ambos. Eles podem ser usados ​​para quantificar DNA para análise do ciclo celular (por exemplo, PI, 7-AAD, DyeCycle Violet, DAPI), classificar cromossomos (por exemplo, Hoescht 33342, Cromomicina A3), classificar células-tronco usando análise de população lateral (por exemplo, Hoescht 33342), células vivas e mortas são diferenciadas e bactérias são classificadas.

O nível de proliferação pode ser determinado combinando corantes de ácido nucleico com outro marcador, tal como um anti-bromodeoxiuridina conjugado com corante fluorescente (BrdU).

9. Corantes de proliferação celular

A proliferação celular é medida incubando células com BrdU (bromodeoxiuridina), que é incorporada na síntese de DNA celular e depois corada com anticorpos e corantes de DNA direcionados contra BrdU. No entanto, este método não é adequado para estudos de proliferação a longo prazo.

O éster succinimidílico de carboxifluoresceína (CFSE) pode ser usado para rastrear múltiplas divisões de células em proliferação. Variantes vermelhas e roxas dos corantes CFSE também estão disponíveis. Em concentrações apropriadas, estes corantes não afetam o crescimento ou a morfologia celular, tornando-os adequados para estudos de proliferação a longo prazo.

10. Corante de morte celular

A viabilidade celular pode ser determinada por corantes de exclusão (por exemplo, iodeto de propídio, DAPI) ou pela ligação de corantes a aminas intracelulares.

Os corantes de exclusão não podem ser fixados e são adequados apenas para células que não são infecciosas e requerem análise imediata.

Corantes de amina incluindo Live/Dead (ThermoFisher), Zombie (Biolegend) ou Fixable Viablity (BD Biosciences) são adequados para células fixas e, portanto, aquelas com células infecciosas, células coradas com antígenos intracelulares, células fixadas com paraformaldeído.

11. Corante indicador de cálcio

Os corantes indicadores de cálcio sofrem uma mudança de cor ao se ligarem ao cálcio e podem ser usados ​​para indicar ativação e sinalização celular.

O corante mais comumente usado ainda é o indo-1, a sonda bifásica de cálcio UV. Existem também sondas de cálcio azul esverdeado para fluo-3.